微生物限度与无菌内毒素区别
无菌检查与微生物限度检查
18
对照品培养基
? 经适用性检查合格的培养基是否可以作为对照培养基 使用？
山东省药品检验所
19
? 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的 培养基，用于培养基适用性检查。由中国药品生物制 品检定所研制及分发。
山东省药品检验所
20
稀释液、冲洗液的问题
? 如何选择稀释液和冲洗液？ ? 薄膜过滤法中规定总的冲洗量不得超过1000ml，而对
山东省药品检验所
22
验证用菌种的问题
? 验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度所用菌 种的基础上，删除了铜绿假单胞菌，增订了大肠埃 希菌。
在验证试验的实践中，发现作为革兰氏阴性杆 菌代表的铜绿假单胞菌在验证试验中对大部分抗生 素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主 的抗生素敏感性较好。
山东省药品检验所
山东省药品检验所
9
企业生产区域环境菌库的建立
当企业产品的灭菌条件和产品稳定性之间产生矛盾 时，该如何处理？
山东省药品检验所
10
解决方案： ? 建立生产过程中关键区域的微生物监控体系，通过长期监控，找
出关键区域常见抗性菌株，并据此建立新的灭菌条件。 ? 否则，如果环境中监测到更强的耐热菌株，则应立刻停止生产，
自2002年微生物专业委员会成立至今，我国药品微生 物检验有了革命性的进步， 2005版药典明确了对检测 环境的要求、对标准的制订原则做了科学的修订及引 入验证理念等； 2010版药典增加对培养基适用性检查、 新增了药品微生物实验室规范指导原则等 4个附录。从 人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、 文件、实验记录、结果的判断等方面提出了明确的要 求。
? 核心实验区可按具体工作需要划分为数个试验单元，核心区各实验单元最 好独立运行 ，核心区与PII级生物安全区不得共用一套换风系统，严格控制 交叉污染的发生。
2010版药典微生物与无菌_
三：微生物限度检查增修定内容 四：新增微生物限度检查法指导原则
⒑结果的判断
由于微生物试验的特殊性，在实验 由于微生物试验的特殊性， 结果分析时， 结果分析时，应从各个可能的方面去 考虑，不但要假设被污染，而且要考 考虑，不但要假设被污染， 虑微生物在原料、 虑微生物在原料、辅料或试验环境中 存活的可能性。此外， 存活的可能性。此外，还应考虑微生 物生长特性。 物生长特性。
甘油冷冻管保存法
甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般 可保存2 可保存2年。 ①将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经 37℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮 37℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮 取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调 整菌液浓度，使其等同于1 整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。 ②向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为 20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 ③轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装 ③轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装 于无菌小试管中，在-30℃ 于无菌小试管中，在-30℃条件下贮存。
一、进一步确定了无菌检查法的定义： 进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医 疗器具、原料、辅料、 疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌 一种方法。 的一种方法。 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止 检验全过程必须严格遵守无菌操作， 再污染 ，但采用的措施不得影响微生物的生 长。 2 、无菌检查要进行环境检测增加了日常检验 无菌检查要进行环境检测增加了日常检验 要进行环境检测增加了 还需进行环境检测。 还需进行环境检测。 2、无菌检查人员必须具备微生物专业知识， 无菌检查人员必须具备微生物专业知识， 并经过无菌技术的培训。 并经过无菌技术的培训。
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
钟长鸣;陈希;吴燕红
【期刊名称】《中国药品标准》
【年(卷),期】2011(12)1
【摘要】@@ 有些药品由于其自身杀菌和抑菌作用,在微生物限度和无菌检查时就有可能出现假阴性结果,为使检查结果真实可靠则必须消除其自身杀菌和抑菌作用.消除药品自身杀菌和抑菌作用的方法有:培养基稀释、离心沉淀集菌、薄膜过滤、中和等方法.寻找一种恰当的能消除药品其自身杀菌和抑菌作用的方法是其方法验证的内容.我所在开展方法验证工作中发现存在一些问题.
【总页数】2页(P12-13)
【作者】钟长鸣;陈希;吴燕红
【作者单位】江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029
【正文语种】中文
【中图分类】R927
【相关文献】
1.对替硝唑注射液无菌检查方法验证中不同厂家集菌器使用问题的探讨 [J], 凌真;陈莹洁;丁莉
2.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 国明;祝清芬;郑力真
3.加强药品无菌检查和微生物限度检查方法验证的对策 [J], 赵建英;寿文虹;李爱玲
4.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 李红
5.微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题 [J], 郭焕君
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2015版药典无菌检查法与微生物鉴定
μm
A级 3520准(1)
浮游 菌 cfu/ m3
沉降 表面微生物
菌 接触碟 （f9 / 0mm）（f55 cfu mm） /4h(2) cfu /
5指手 套 cfu /手 套
<1 <1 <1 <1
B级 3520
29
352000 2900
10 5
5
5
C级 352000 2900 3520000 29000 100 50 25
2015版中国药典通则
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
洁 静态 净
动态
度
级 ≥0.5
≥5.0 ≥0.5
≥5.0
别 μm
μm μm
比较项目
检验条件规定 人员要求 培养基、培养 条件与时间
培养基灵敏度 检查与方法验 证用菌株 检验方法 稀释剂与薄膜 过滤冲洗液
结果判断与复 试规定
ChP2010
USP35
EP7.0
总体10000级、局部100级
应在无菌条件下进行。
应在无菌条件下进行。
具备微生物专业知识，并经过无 经培训和认可 菌技术的培训
经培训和认可
硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃；20～25℃(三部 ）
改良马丁培养基 23～28℃
均培养14天，
转种后细菌培养2天、真菌培 养3天
硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天
无菌、微生物限度、细菌内毒素方法学验证
问题：生长缓慢的判断标准？
敏感菌株与阳性对照菌
阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌 株
问题：降低了阳性对照菌的意义，实际 工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多 （敏感菌株），但阳性对照只能选择金 黄色葡萄球菌。
关于大肠埃希菌的问题
供试品无菌检查中规定“抗革兰阴性菌 为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”， 但在方法学验证中所用菌株没有大肠埃 希菌。 解决措施：抗革兰阴性菌的抗菌药物进 行方法学验证时增加大肠埃希菌。 即将修订，将铜绿假单胞菌修订为大肠 埃希菌。修订后按新方法执行。
问题：冲洗条件、冲洗量的选择
有些厂家提供的验证资料中，对非抑菌
性供试品也采用大量的冲洗，100ml/次 *10次/膜，增加了出现误差的机会。 1. 对膜的损伤 2. 检验方法繁琐，大大增加检验人员 的工作量（检验要按照已经验证的方法 进行） 3. 验证试验方法选择总的原则是由易 到难
结果判断：
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均 生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下 无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检 查法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢 或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下
有抑菌作用。
消除供试品抑菌的方法
药品无菌和微生物限度检查法验证作为中国药 典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品 微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行
近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药
品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和 严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要）
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。
热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查
热源、无菌、细菌内毒素、微生物限度检查的关系前面看到过关于无菌和内毒素区别的帖子。
那么请问各位，热源、无菌、细菌内毒素和微生物限度检查究竟有什么区别，又有什么联系呢？本人我在微生物方面比较白，只是觉得这四项都和细菌有关，都需要培养基，都要在无菌台里做…… 汗~~ 其他的实在不知了。
头都大了，希望各位指点迷津，谢谢。
[楼主] | Posted:08-09-09 10:22|珊瑚礁级别: ★会员发帖: 292威望: 6财富: 95注册时间:2008-03-06最后登陆:2010-11-25无菌，最终灭菌产品和百级生产非灭菌产品需要检测的项目，一般采用薄膜过滤法；如，粉针剂、大输液产品。
微生物限度，允许结果有菌落，但有限度，是一定范围，一般采用半封闭薄膜过滤法和平皿法。
指非灭菌产品，如口服制剂和食品、外用药。
热源，目前很多品种采用细菌内毒素检测方法代替，简单，成本低。
但必须按照国家标准。
内毒素和热源一般是大输液产品的检测项目。
想了解很多，应该多看看专业书籍啊[1 楼] | Posted:08-09-09 12:21|洲际捣蛋级别: 论坛版主发帖: 2500威望: 315财富: 42注册时间:2008-03-15最后登陆:2010-11-08热原---不需要培养基兔法看药典就知道是怎么回事了细菌内毒素----不需要培养基一般工作环境也可以做无菌----需要培养基薄膜过滤法直接接种法也可以参照药典微生物限度检查----需要培养基薄膜过滤法梯度稀释图布平板法区别：热原和细菌内毒素检验方法的不同但检验的东西在本质上其实是一样的另外细菌内毒素检查法要比热原检查法灵敏10倍，根据各种药物的特性，规定检查热原还是细菌内毒素。
注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-10-11zyb3421060级别: ★会员发帖: 65威望: 3财富: 1注册时间:2008-03-10最后登陆:2010-11-12还不是很明白[5 楼] | Posted:08-12-25 08:26|shabb007级别: ★★会员发帖: 649威望: 20财富: 20注册时间:2007-12-14最后登陆:2010-12-03这么说吧。
药品无菌检查和微生物限度检查有关问题的解答
无菌与微生物限度试验用试验用菌种生物学特征一、金黄色葡萄球菌1、学名：细球菌属化脓性细球菌种。
金黄色变种（Micrococeus pyogens Var.aureus）试验用菌种金黄色葡萄球菌（26003）是经过人工驯育的无毒菌株，但亦可能变异，在传代接种中应注意安全。
2、形态与染色圆球形排成典型的葡萄串状，直径0.4~1.2μ，平均0.8μ，致病性者直径一般较非致病性者的直径为少。
无鞭毛，不能运动，不产芽胞，G+阳性，当衰老、死亡或对青霉素产生抗性的某些菌株亦复染成G-3、培养特性：肉汤培养基上生产良好，28~38℃生长较好，pH4.5~9.8以pH7.4最好。
肉汤平板24~48小时形成圆形凸出，边缘整齐，表面光泽且金黄色，直径1~2毫米（应挑光滑型菌种）血平板，有或无，A溶血性太多具致病性4、色素的产生：以22℃较37℃时为多，当37℃培养后，移致室温（22℃）一定时间，色素可见增加。
氧有利于色素产生。
培养基中含糖，牛乳时色素产生较多。
色素属酯溶性色素。
5、抵抗力：6、生化反应：葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、产酸不产气、甘露醇+、甲基红+、VP弱阳性、吲哚－、尿素+、硝酸盐还原+、明胶液化+、分解精氨酸产氨。
生检用途：抗生素效价测定用生物指示菌。
二、枯草芽胞杆菌：1、学名：杆菌属枯草杆菌（Bacillun Subtilis）一般无致病性（63501）2、形态与染色：菌体细短棒状，0.7~0.8μm－2.0~3.0μm，单个或成链状，二端半圆形,，染色均匀，芽胞0.6~0.9－1.0~1.5μ，为椭圆形或圆柱形。
常产生于菌体中央或接近中央。
G+能运动。
3、培养特性：兼性厌氧或需氧。
肉汤平板，呈粗糙型，变异时可出现光滑型。
液体表面形成皱状原膜，粘附于试管壁上。
最适温度30~37℃，生长范围15~55℃。
明胶+、淀粉+、VP+、硝酸还原+、卵磷酯-、C盐+、G.蔗糖，甘露醇+、乳糖-。
生检用途：抗生素效价测定用生物指示菌。
药品无菌检查和微生物限度检查有关问题的解答
无菌与微生物限度试验用试验用菌种生物学特征一、金黄色葡萄球菌1、学名：细球菌属化脓性细球菌种。
金黄色变种（Micrococeus pyogens Var.aureus）试验用菌种金黄色葡萄球菌（26003）是经过人工驯育的无毒菌株，但亦可能变异，在传代接种中应注意安全。
2、形态与染色圆球形排成典型的葡萄串状，直径0.4~1.2μ，平均0.8μ，致病性者直径一般较非致病性者的直径为少。
无鞭毛，不能运动，不产芽胞，G+阳性，当衰老、死亡或对青霉素产生抗性的某些菌株亦复染成G-3、培养特性：肉汤培养基上生产良好，28~38℃生长较好，pH4.5~9.8以pH7.4最好。
肉汤平板24~48小时形成圆形凸出，边缘整齐，表面光泽且金黄色，直径1~2毫米（应挑光滑型菌种）血平板，有或无，A溶血性太多具致病性4、色素的产生：以22℃较37℃时为多，当37℃培养后，移致室温（22℃）一定时间，色素可见增加。
氧有利于色素产生。
培养基中含糖，牛乳时色素产生较多。
色素属酯溶性色素。
5、抵抗力：6、生化反应：葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、产酸不产气、甘露醇+、甲基红+、VP弱阳性、吲哚－、尿素+、硝酸盐还原+、明胶液化+、分解精氨酸产氨。
生检用途：抗生素效价测定用生物指示菌。
二、枯草芽胞杆菌：1、学名：杆菌属枯草杆菌（Bacillun Subtilis）一般无致病性（63501）2、形态与染色：菌体细短棒状，0.7~0.8μm－2.0~3.0μm，单个或成链状，二端半圆形,，染色均匀，芽胞0.6~0.9－1.0~1.5μ，为椭圆形或圆柱形。
常产生于菌体中央或接近中央。
G+能运动。
3、培养特性：兼性厌氧或需氧。
肉汤平板，呈粗糙型，变异时可出现光滑型。
液体表面形成皱状原膜，粘附于试管壁上。
最适温度30~37℃，生长范围15~55℃。
明胶+、淀粉+、VP+、硝酸还原+、卵磷酯-、C盐+、G.蔗糖，甘露醇+、乳糖-。
生检用途：抗生素效价测定用生物指示菌。
2010年版药典附录无菌检查和微生物限度检查方法存在问题及修定内容 ppt课件
四、试验稀释液、冲洗液 ⒈ 增加根据供试品的特性，可选用其他经验证过
的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。 ⒉试验中使用的中和剂、灭活剂和表面活性剂
除证明其有效性外还应证明对污染的微生物无 影响修改为无毒性。
2021/4/3
五、方法验证试验
⒈试验菌株 大肠埃希菌替代铜绿假单胞菌
⒉供试品用量 薄膜过滤法 取每种培养基规定 接种的供试品总量。
2021/4/3
六、供试品的无菌检查法
⒈检验量 直接接种法除另有规定外，每份 培养基接种的供试品量按表2、表 3规定。
2021/4/3
⒉薄膜过滤法 ⑴滤膜选择 抗生素供试品滤膜应选择低吸附的 滤器及滤膜。 ⑵冲洗量 每张滤膜每次冲洗量一般为100ml， 总冲洗量不得超过1000ml 。 ①水溶液供试品 含抑菌成分所用的冲洗量、冲洗方法同方法验及保存条件。 菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用
，若保存在2～8℃可以在24小时内使用。黑曲霉 孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内 使用，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝 固，按规定条件培养计数，同时用相应的对照培 养基替代被检培养基进行上述试验。 ②对照培养。
三、培养基
⒈删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基 的使用范围。
⒉删去选择性培养基使用的表面活性剂种类
2021/4/3
3、培养基灵敏度试验 ⑴ 菌悬液制备中黑曲霉菌悬液的制备 “用适
宜的方法吸出孢子悬液”。 ⑵在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加入0.05％
v/v）聚山梨酯80。
2021/4/3
2021/4/3
2. 常见干扰物的中和剂和灭活方法 参见 表1常见干扰物的中和剂或 灭活方法。
2021/4/3
药典附录无菌检查和微生物限度检查方法增修定内容
表3 （表题）将上市抽验样品（固体制剂）的最少检验 量 修改为固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验 数量” 第三列最少检验数量、≤1 全量 ２0 ① 修改为 供试品最少检验数量（瓶或支） １0 ① 注① 每种培养基接种１０支培养基修改为若供试品每 个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最 少检验数量加倍。
一、抑菌剂效力检查法指导原则
⒈指导原则的目的 ⑴是为测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评 价最终产品的抑菌效力及生产企业在制剂研发阶段抑 菌剂的确定提供指导。 ⑵为防止药品由于微生物污染而引起变质，对服用者 造成不良反应，在药品生产过程中加入一定剂量的抑 菌剂。 ⑶抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作 为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作 为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
2010年版药典附录无菌检查和微生物
限度检查方法增修定内容
起草的指导思想
一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、 环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，着 力解决发展中的问题。 二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自 主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国 药品标准总体水平，着力提升《中国药典》在国 际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进 医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会 作出贡献。
2010年版无菌检查法增修订内容
一、进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、 原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ， 但采用的措施不得影响微生物的生长。 2 、无菌检查要进行环境检测增生物专业知识，并经过 无菌技术的培训。
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微生物限度与无菌内毒素
区别
Last revision date: 13 December 2020.
微生物限度-无菌-内毒素区别与联系
微生物检测基本就这3项了。
微生物限度：用营养琼脂、玫瑰红钠培养。
洁净度中等操作台内进行（B级)
无菌：硫乙醇酸盐、改良马丁在无菌套筒里操作并培养。
洁净度要求较高(A级）
内毒素：鲎试剂稀释不同浓度来判定。
洁净度要求不高，D级情况下即可。
我的理解微生物泛指细菌和霉菌酵母菌等等、应该是包罗万象，各种杂菌都有
无菌则也是各种杂菌与微生物限度检测的微生物有什么区别
内毒素是一种热源，服用没什么关系，在注射后容易导致人体发热。
内毒素是革兰氏阴性中的一种成分，叫做脂多糖。
脂多糖对宿主是有毒性的。
内毒素只有当死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
耐高温
比如说注射液产品用气接触产品，他应该用滤器过滤其他吧。
用膜直径改用（过滤）的好还是（除菌）的好滤膜泡点肯定要做的，高风险产品应该要最少2层滤膜吧。
用了这滤膜可以不用检这3项还是要检其中项目而且有的企业只是一年验证一下，不对气体日常可行吗
求大神详解3者的联系与区别，各什么时候需要检这3项及为什么。
答：微生物限度针对非无菌产品
无菌和内毒素针对无菌产品。
微生物限度，无菌检验，内毒素检验均为供试品安全性检测。
主要区别是微生物限度，无菌检验是检验活的微生物方法，内毒素检验可以检验死去的微生物中内毒素含量。
什么时候选用不同的检验方法，主要参见药典要求，例如口服制剂选择微生物限度，注射剂和眼用制剂选择无菌检验，注射剂也需要做内毒素检验。
选择不同实验方法主要依据是供试品生物风险级别和供试品用途。
例如纯化水检验中不需做内毒素实验，注射用水检验中不需做无菌实验。
依据是纯化水主要用途为清洗，注射用水用途是配液，所以注射用水的微生物风险更高，需要做内毒素实验，控制风险。
微生物限度和无菌实验用具要求无菌，内毒素实验用具要求去除内毒素。
检验环境要求
现行药典微生物限度和无菌实验均是C级下局部A级，微生物限度在超净工作台，无菌实验在生物安全柜内操作。
也可以选择D级下隔离系统中操作。
内毒素实验对环境无要求，在普通操作台上操作即可。