两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究
辽宁省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析
ｎ ｇ ｓ ｕ ／ ４ ０ ／ ２ ０ １ １（ Ｈ１ Ｎ Ｉ ） 株 的 同源 性 相 对 最 高 ， 结果 表 明 ，分离 株 Ｈ Ａ基 因与古 典 型 Ｈ１ Ｎ Ｉ ａ
９ ． ４ ％，序 列分析 结果表 明，分 猪 谱系 的同源 性不高 ，核苷酸 同源性 为 ６ ９ ． ７ ％～ 核苷酸 同源性 为 ９ Ｎ １ 亚 型猪 流感病 毒 ，与不 ７ ２ ． １ ％；与 类 禽 型 Ｈ １ Ｎ １ 猪 谱 系 的 同源 性 较 高 ， 离株 为类 禽 型谱 系 Ｈ１ 为９ ０ ． ８ ％， － ￣ ９ ９ ． ４ ％，其 中与猪流感病 毒 Ａ ／ ｓ ｗ ｉ ｎ ｅ ／ Ｊ ｉ ． 同谱系 Ｈ１ Ｎ １ 代表毒株序列 比对情况见表 ｌ。 表１ 分离株 Ｓ ｗ ／ Ｌ Ｎ ／ ｏ １ ／ １ ２ （ Ｌ Ｎ株 ） 序 列比对分析
Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ １ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｓ ｗ／ Ｌ Ｎ ／ ０ １ １ １ ２ ｗｉ ｔ ｈ ｒ ｅ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ
２ ． ３ ． ２ 神 经氨 酸 酶基 因（ Ｎ Ａ） 分离株 Ｎ Ａ基 因 ＷＶ Ｌ ７ ／ １ ９ ９ ２ （ Ｈ ｌ Ｎ １ ） 相 比，在 ６ Ｏ 位增加 了一个糖基 编码区长 ｌ ４ ４ ０ ｂ ｐ ，编码 ４ ７ ９ 个氨基酸，Ｎ Ａ 颈部没 化 位 点 Ｎ Ｑ Ｓ ，在 ３ ９ ６ 位 失去 １ 个 糖基化位 点 Ｎ Ｆ Ｓ 。 生 位点分析发现，病毒 Ｎ Ａ 蛋 白氨基酸第 ２ ７ ４ 有氨基酸缺失。Ｎ Ａ 基 因推导的氨基酸序列中含有 ７ 对耐药 Ｉ
畜牧 兽 医
唼瞒防治
Ｌ Ｎ ＨＡ ｓ ｅ ｑ
Ａ ｎ ｅ Ｓ ｈ ８ ａ ｒ ｌ ｘ ｉ ｓ ２ ２ ０ １ ２ （ Ｈ １ Ｎ ¨ ｓ ｅ ｑ
猪流感病毒免疫应答反应的研究进展_田亮 (1)
3 展望
尽管猪流感所致的死亡率不高，与其他病毒性猪传 染病相比，造成的经济损失也小得多，但由于猪是人流 感和禽流感的“混合器”，又由于猪可以作为人流感病毒 的存储器，在猪体内保持很长时间，在适当的条件下， 这些病毒可在人群中造成流行，因此猪流感具有重要的 公共卫生意义。因此，开展对猪流感免疫应答反应的研 究，不仅对猪流感病的防治具有重要意义，而且对禽、 人流感的研究具有参考价值。
明母源抗体保护猪抵抗临床感染初期的流感病毒，但这 些保护并不完全。Kitikoon 等[25]研究表明，母源抗体抑 制血清中的抗体反应，用二价的灭活疫苗免疫后能诱导 产生猪流感病毒的特异性记忆 T 细胞。有母源抗体的猪 免疫后，用异源的 H1N1 病毒攻击时，可观察到肺炎症 状明显。 2.2.2 H1N1 和 H3N2 流感病毒
Bateman 等[7]用 H3N2 型和人源重组基因的猪流感 病毒感染呼吸道上皮细胞，其能够在富含维甲酸和表皮 生长因子的培养基的气液界面生长，甚至在缺少外源性 胰蛋白酶的情况下也能生长。Sun 等[8]证明，人型、猪
收稿日期：2014-08-27
China Swine Industry 45
猪病防控
接种猪流感病毒 H1N1 的猪体内，检测到具有生物 活性的 α-IFN、α-TNF 和 IL-1，细胞因子在发病初期 广泛存在，并且伴有呼吸道症状甚至引起支气管坏死。 研究显示，α-IFN、α-TNF 和 IL-6 与肺中病毒量和症 状的严重程度有关，表明其与猪流感病毒发病机理有关[26]。
H1N1亚型猪流感灭活疫苗的研制及免疫效果试验
猪流感 单独 感染 猪群 的病 死 率 较低 ， 但是 由于
猪是人 流感 和禽 流 感 的混 合 器 ， 在 猪 的 呼 吸道 兼 有
术 有 限公 司 ， 自行 孵 化至适 合 日龄 使用 。 １ ． １ ． ４ 试剂 受体破 坏酶 （ Ｒ ＤＥ Ⅱ） 购 自日本 生研
南 农大 生 物 药 品有 限 公 司 制 备 和 提 供 。Ｍａ ｒ ｃ ｏ ｌ － ５ ２ 白矿 油 、 司本一 ８ ０ 、 吐温一 ８ Ｏ ， 硬 脂酸 铝等均 购 自广 州俏 灵儿 生物科 技有 限公 司。
猪 流行 性 感 冒（ Ｓ ｗｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ｆ ｌ ｕ ｅ ｎ ｚ ａ ， Ｓ Ｉ ）简 称 猪 流
感疫苗 的研 发提供 科学 的试验 数据 。
感， 是 由正 黏病 毒科 Ａ 型流感 病 毒属 的猪 流感 病 毒 （ Ｓ ｗｉ ｎ ｅ ｉ ｎ ｆ ｌ ｕ ｅ ｎ ｚ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｓ Ｉ Ｖ） 引 起 的猪 的一 种 急性 、 热性 、 高度接 触性 呼吸 道传 染 病 ， 临床 上 以突 发 、 高 热、 咳嗽 、 呼 吸困 难 、 反 复发 作 、 发病 率 高 、 病 死 率低
１ ． ２ 方 法
人流感 和禽 流感 的唾液 酸受体 。这 一特 征就 决 定 了 公 司 ； ＨＩ Ｎ１ 亚 型猪流 感病 毒灭 活抗 原 ， 由广州 市 华
猪流 感 有 可 能 感 染 人 ， 因 而 有 重 要 的 公 共 卫 生 意
义 。 目前 预 防猪流感 最好 的方法 仍 然是 疫苗 免疫 接种 。本研 究利 用近年 来分离 到 的 ＨＩ Ｎ１ 亚 型猪 流 感 病毒 Ｓ Ｇ Ｄ ０ １株 ， 研 制 出猪 流 感 油乳 剂 灭 活 疫苗 ， 并对该疫 苗 的免 疫 接 种效 果 进 行研 究 ， 以期 为猪 流
猪流感病毒在自然感染猪中定植区域的研究
猪流感病毒在自然感染猪中定植区域的研究郑 杰 赵 朴 译 卢中华 校 (河南农业大学牧医工程学院 郑州 450002) 猪流感病毒感染是全世界养猪国家常遇到的一种呼吸道疾病。
感染猪通常表现为突发呼吸道疾病、高热、食欲减退、体重减轻、嗜眠、眼和鼻有分泌物、咳嗽、呼吸困难;高发病率和低死亡率(病死率<5%)最普遍。
组织学检查可发现支气管和细支气管上皮退化、坏死。
支气管、细支气管、肺泡腔内充满了含有脱落细胞、嗜中性细胞、单核细胞的渗出物。
猪流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属成员,基因组为八个片段的单链副股RNA分子。
已从猪中分离到两个亚型的A型流感病毒:H1N1(经典代表株H1N1和禽H1N1)和H3N2(代表株为人H3N2)。
RNA片段5编码主要的结构蛋白与RNA的片段型特异性抗原组成核蛋白。
核蛋白是典型的抗原,用于区分A、B、C型流感病毒。
A型SIV核蛋白基因的核苷酸序列与其它流感病毒显著不同(同源率为60%),但在不同A型流感病毒株之间表现为高度保守(同源率可达90%)。
因此,以核蛋白基因转录的互补DNA(cDNA)可特异性地用于A型SIV的检测。
病毒的分离是诊断猪流感病毒(SIV)感染的经典方法。
然而,病毒的培养既费时又昂贵。
从可能被病毒污染的样品中分离病毒时要小心处理,防止在分离过程中传染给人。
人感染SIV,一部分是致死性的,这在美国、欧洲已有报道。
由于SIV的流行特点,人们已经采用基于单抗、多抗介导的免疫组化不同检测方法检测用甲醛固定,石蜡包埋组织中的抗原。
检测猪流感病毒的另一种方法是原位杂交,原位杂交是用于评价组织和细胞中基因表达水平的RNA的有力助手,它的主要优点是能够确定样品混合物中的哪些组织和细胞表达目的RNA,病毒RNA的cDNA探针原位杂交技术已经成功地用于病毒核苷酸的检测。
本研究的一个目的就是利用地高辛标记的,互补SIV核蛋白的基因保守区的582bp的单股cDNA探针检测用甲醛固定,石蜡包埋的组织中SIV的核酸。
2009年上海分离的2株猪源甲型H1N1流感病毒
Ｃｈ ｒ ｃ ｒｓ ｃ ｆ ｗｏＳ ｎ － ｉｉ ０ ９Ａ（ Ｎ１ ｉｆ ｅ ｚ ｉｕ ｏａｅ ｎＳ ａ ｇ ａ ａ ａ ｔ ｉ ｉｓ ｗｉｅＯｒ ｎ２ ０ Ｈ１ ） ｎ ｕ ｎ ａｖｒ ｓｉ ｌｔｓ ｈ ｎ ｈ ｉ ｅ ｔ ｏ ｔ ｇ ｌ ｓ ｉ
研 究从上海地 区较 早发 现 的两个输入 性 甲型 Ｈ１ Ｎ１流感病例 样本 中分 离出 ２株 病毒 ，分别命名 为 Ａ Ｓ ａ ｇａ／７ ／０ ９和 Ａ Ｓ ａｇ ａ ７ Ｔ２ ０ 。ＭＤ Ｋ 细胞培养 上清中的病毒通过 电镜 显示，该 病毒 ／ｈｎ ｈ ｉ Ｔ２ ０ ３ ／ｈｎ ｈｉ １ ／０ ９ ／ Ｃ 的直径大约为 ６ ～ ０ ｍ，具包膜 ，包膜表 面有突起 ，呈现 出正粘病毒颗粒形态特征 。免疫荧光检 测显 ０ ８ｎ 示，ＭＤＣ 细胞 内病毒成分能与病人 恢复期血 清反应。２株病毒 的全基 因核酸序列和氨基酸序列与美 Ｋ 国参考株 Ｃ ｌｏ ａ ４具有 高度 的同源性；基 于全基 因的系统发 育分析 ，确认 此 ２株病毒属于 ２ ０ ａｉ ｍｉ ｆ ０ ０ ９年 在全球暴发流行 的新型 Ｈ１ Ｎ１甲型流感病毒 。在 此基础上 的进一步研 究发现，２株病毒 可诱 导 Ａ５ ９细 ４ 胞 中抗病毒 效应基 因的表达；经 Ｉ 型干扰 素预处理 的细胞可有效抵抗病毒 的感染，提示其潜在的保 护作 用。综上所述 ，上海分离 的 ２株病毒和 ２ ０ ０ ９年北美暴发的猪源 甲型 Ｈ１ 流感病毒是 同源的，并且在 Ｎ１ 病毒的致病性 ，药物的抗性和抗原性方 面没有发 生变异。 关键词 ：甲型 Ｈ１ 流感病毒；上海 ２ ０ ；病毒分离；核酸测序；进化树 分析 Ｎ１ ０ ９年
著 术
２ ０ 年 上 海 分 离 的２ ０９ 株猪 源 甲型Ｈ１ 流 感 病 毒 Ｎ１
2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析
2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析作者：孔子荣李三木何奇松曾咏芳杨可妍冯淑萍孙翔翔熊毅颜健华来源：《南方农业学报》2020年第09期摘要：【目的】明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性（抗原性、耐药性和致病性），为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据。
【方法】以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒（SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株）为研究对象，运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段（HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因），经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析。
【结果】2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框（ORF）分别是PB2：2280 bp、PB1：2274 bp、PA：2151 bp、HA：1683 bp、NP：1497 bp、NA：1410 bp、M：982 bp和NS：838 bp。
2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高，而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高，在基因型分类上属于G57基因型，为我国广泛流行的H9N2亚型基因型。
2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变，NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变，但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变，且M2氨基酸位点发生S31N突变。
2株广西猪源H9N2亞型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点（NCS）;NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点，也未出现NA蛋白颈部杆状结构63～65 aa缺失现象，在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234 aa处非常保守，但发生W402S突变。
实验性感染猪源H1N1流感病毒引发疾病
同 时检 测 猪 繁 殖 与 呼吸 综 合 征 病 毒 、猪 瘟 病 毒 、猪 圆环 病 毒 的 多重 Ｐ ＣＲ技 术
本试验 设计 了一 种多重聚合 酶链 反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ）技 术 ，可
用 于 同 时检 测 与猪 繁 殖 和 呼 吸 衰 竭相 关 的 ３种 病 毒一 猪 繁
（ ｐ Ｈ１ Ｎ１ ） 和 其 重组 毒 株 （ ｒ Ｈ１ Ｎ１ ） 分 别 注 射 到 两 组 ３周 龄 的 猪 体 内 ，每 组 ９只 ，一 组 注 射 ｐ Ｈ１ Ｎ １ ，另 一 组 注 射 ｒ Ｈ１ Ｎ１ ，
毒混 合 感 染 的 为 ３ ． ６ ６ ％。 总 之 ，此 多 重 Ｐ ＣＲ技 术 适 用 于 常 规
的分子诊 断和流行 病学诊断 ，可有效地 检测 出上述 ３种病 毒
的单 一 感 染 或 混 合 感 染 。 （ 陈 舒 楠 编译 ，译 自 份 子 与 细 胞
探 测》 ）
注 ：肺 部 病 变呈 紫 红 色 ，病 灶 多联 合 或 呈 棋 盘 式 分 布 （ 箭头 ）
图 １ ｒ ｌｌ ｉ Ｎ１感 染 ２天 后 肺部 病 变
试 验 结 果 显 示 ，感 染 病 毒 的 两 组 猪 只 均 呈 现 不 同 程 度 的 典 型 流 感 样 临 床 症 状 和 组 织 病 理 学 变 化 ，在 注 射 病 毒 后 １ ～ ４
译 自 ：Ｌ ｉ ｕ Ｊ Ｋ ， Ｗｅ ｉ Ｃ Ｈ， Ｙ ａ ｎ ｇ Ｘ Ｙ， ｅ ｔ ａ １ ． Ｍｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｅ ｘ Ｐ Ｃ Ｒ ｆ ｏ ｒ
ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｍｕ ｌ ｔ ａ ｎ ｅ ｏ ｕ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｅ ｐｒ ｏ ｄｕ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｓ － ｐ ｉ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｓ ｙ ｎ ｄｒ ｏ ｍｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，ｃ ｌ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｗｉ ｎ ｅ ｆ ｅ ｖ ｅ ｒ ｖ ｉ ｒ ｕｓ ，ａ ｎ ｄ ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｃｉ ｒ ｃ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｉ ｎ ｐ ｉ ｇｓ Ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ａ ｎ ｄ Ｃｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ Ｐｒ ｏｂ ｅ ｓ ，
H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救及其致病基因的分析的开题报告
H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救及其致病基因的分析的开题报告一、选题背景猪流感是一种由猪流感病毒引起的呼吸道传染病，可以引起猪的高烧、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕等症状。
猪流感病毒分为H1N1、H3N2、H1N2等亚型，其中H1N1和H3N2亚型病毒对人类具有较高的感染性和致病性，可能引起公共卫生事件。
近年来，全球多次发生了猪流感病毒感染人类的疫情，引起了广泛关注。
二、研究意义猪流感病毒的病原机制和致病基因一直是研究的热点和难点之一。
对于H1N1和H3N2亚型病毒的拯救和致病基因的分析，具有重要的理论和实践意义。
一方面，研究猪流感病毒的致病机制和途径，可以为疫苗和药物的研发提供依据和指导；另一方面，通过分析病毒的遗传变异和流行规律，可以为预防和控制疫情提供理论基础和科学支撑。
三、研究目的本研究的目的是探究H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救和致病基因的分析，进一步了解病毒的遗传变异和传播规律，为预防和控制疫情提供科学依据和支持。
四、研究内容和方法本研究将采用文献综述、实验研究和分子生物学技术等方法，对H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的拯救和致病基因进行深入研究和分析。
具体包括以下几个方面：（1）通过文献综述，探究猪流感病毒的遗传特点、感染规律和致病机制等方面的研究进展。
（2）采用分子生物学技术，对H1N1和H3N2亚型猪流感病毒的基因组结构和遗传变异进行深入分析和解读。
（3）利用细胞培养和动物模型等实验方法，研究病毒感染和复制规律，筛选和鉴定病毒的致病基因。
（4）通过大规模的基因测序和生物信息学分析，探究病毒的演化变异和传播规律，为预测和防控疫情提供科学依据。
五、研究总体安排本研究计划用时2年，在第1年主要进行文献综述和实验技术的优化和建立；在第2年主要实验研究和数据分析。
具体研究安排如下：第一年：（1）文献综述和调研。
（2）实验技术建立和优化，包括基因组分离、PCR扩增、蛋白表达、分子克隆和动物模型建立等。
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两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究何剑桥;韦祖樟;欧阳康;黄伟坚;陈樱;何平;赵卫锋;周华波;丁仰保;梁明丽;祝健;李瑞凯;莫彦宁【摘要】选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄仔猪,从而探究新型甲型重组犬流感病毒对猪的致病性.试验发现CIV-QZ5及SIV-QZ5均能有效感染仔猪,攻毒仔猪均出现发热(≥39.5℃)、流鼻涕、食欲减退、活动减少等流感症状,其中CIV组出现1头仔猪(A3)死亡.通过对肺脏灌洗液进行病毒滴定,发现CIV组在攻毒后3d和5d 在肺脏的复制能力较SIV组强,最高达到3.121og10 PFU/mL.病理剖检发现,肺脏出现不同程度的实变.肺脏病理切片发现两组均出现不同病变,其中以死亡仔猪(A3)最为明显,主要以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征.结果表明,猪源甲型重组CIV不仅能引发猪出现明显流感症状,而且能有效地在肺脏复制,为了解潜在的猪-犬跨宿主传播机制奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2019(040)002【总页数】6页(P45-50)【关键词】H1N1亚型流感;重组病毒;犬流感病毒;致病性;猪【作者】何剑桥;韦祖樟;欧阳康;黄伟坚;陈樱;何平;赵卫锋;周华波;丁仰保;梁明丽;祝健;李瑞凯;莫彦宁【作者单位】广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;南宁市华波宠物医院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004;广西玉林市动物疫病预防控制中心,广西玉林537000【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5;S858.28甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)为负股RNA病毒，基因组包含8个节段，分别为碱性聚合酶2(basic polymerase 2,PB2)、碱性聚合酶1(basic polymerase 1,PB1)、酸性聚合酶(acidic polymerase,PA)、血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)、基质蛋白(matrix,M)和非结构蛋白(nonstructural protein,NS)。
每一个节段分别编码1个或者2个蛋白。
目前，根据表面糖蛋白(HA和NA)抗原的不同，在野禽中发现了16个HA(H1～H16)和9个NA(N1～N9)亚型，但是仅有H1和H3在哺乳动物(人、猪、马和犬)中建立稳定体系。
H5N1和H7N9亚型禽流感病毒感染人引发了数百人死亡[1-2]，但是至今仍未获得人-人传播能力。
2009年暴发的H1N1亚型流感病毒(pdm/09)大流行引发高度关注，研究证实了猪-人传播的事实[3]。
此外，发现H1N1亚型流感也可感染宠物犬。
不仅如此，随着该病毒不断与本地流行毒株发生重组，从猪群和犬群中都陆续分离到多种基因型重组病毒。
Zhu H等[4]监测发现1株新型重配EA毒株(Sw/GD/1361/10)，其基因型特点是携带欧亚类禽(Eurasian avian-like, EA)表面基因(HA和NA)和pdm/09内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)。
2009至2012年的监测中发现猪流感病毒(Swine influenza viruses, SIVs)与北美三重重组(North American triple-reassortant,TR)或EA交替重配，特别是以EA 表面基因与pdm/09内部基因的重组形式频繁在猪群中出现[5]。
而在宠物犬中，韩国也陆续报道了与pdm/09重组的新型重配株。
例如，新型H3N1亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)，其内部基因及NA基因来源于pdm/09谱系[6]；M基因来源pdm/09谱系，其他基因片段来源H3N2 CIV的重组病毒H3N2mv株。
犬和雪貂试验证实其不仅可引起典型呼吸道症状，而且相比原始的禽源H3N2 CIV具有较强的毒力和复制能力，尤其证实了源于pdm/09谱系的M 基因可以增强其复制和传播能力[7-8]。
本实验室前期工作中，首次发现并分离得到了新型重组的H1N1亚型CIV和H1N1亚型SIV。
其基因片段来源组均由欧亚类禽谱系的HA、NA和M基因片段、pdm/09的PB2、PB1、PA和NP基因片段和北美三重重组谱系的NS基因片段组成，从遗传进化分析推断这些甲型重组CIVs来源于猪，因此具有潜在的猪-犬传播的可能性。
为了研究其对哺乳动物的致病性，我们利用小鼠模型进行了前期探索，发现它们能够无适应感染小鼠，在肺脏和上鼻窦能够较好地复制，甚至致死小鼠[9]。
但是有研究表明，目前CIVs不能在猪中进行有效复制[10]。
为了验证这些猪源CIVs是否能有效地感染猪，我们建立了CIVs感染猪的动物模型，为研究猪-犬跨宿主感染提供科学依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验用动物猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测为阴性的3周龄仔猪14头，购自广西大学原种猪场。
1.1.2 毒株 H1N1亚型犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV)和H1N1亚型猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV)。
两株流感病毒均为重组病毒，其病毒基因组重组形式均为：HA、NA、M片段来自欧亚类禽谱系；PB2、PB1、PA、NP片段来自pdm/09谱系；NS片段来自北美三重重组谱系，由广西大学动物科学技术学院传染病与分子免疫实验室分离保存。
1.1.3 主要试剂细胞裂解液RNAiso plus、dNTP、RNasin酶抑制剂、M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/ L)，宝生物工程(大连)有限公司产品；舒眠宁(麻醉药)，广西神九生物制品公司产品；琼脂糖凝胶粉，上海生工生物工程技术服务公司产品；DMEM培养液、胎牛血清，GIBCO公司产品。
1.2 方法1.2.1 动物感染试验将14头试验仔猪分为3组，包括A组(SIV组6 头)、B组(CIV组6 头)和C组(对照组2头)，采取麻醉气管攻毒方式，试验组每头仔猪攻毒2 mL(含106 PFU/mL)病毒液，对照组每头接种2 mL细胞培养液(DMEM)。
攻毒后，观察感染仔猪的临床症状，包括体温变化、采食量、呼吸道症状及排粪情况等。
分别采集对照组及攻毒组攻毒后0、3、5、7 d鼻拭子。
同时攻毒后的3、5、7 d 进行处死，无菌采集各组织器官，包括上鼻窦、气管、肺、心、肝、脾、肾和脑，同时收集肺脏灌洗液，进行空斑测定病毒效价并观察肺脏的病理变化。
1.2.2 样品处理用灭菌棉拭子插入仔猪鼻部，放入含有适量青霉素、链霉素PBS缓冲液中，漩涡振荡1 min后弃去棉拭子，离心后取上清液进行流感病毒检测。
称取仔猪肺脏以及其他组织，每 0.1 g加300 μL的PBS，进行充分匀浆。
然后置于-80 ℃超低温冰箱反复冻融3次，离心后取上清液300 μL，用Trizol法提取RNA进行流感病毒检测。
1.2.3 引物设计与合成根据GenBank中上传的流感病毒M基因片段的保守序列,设计扩增流感病毒特异片段的鉴定引物。
上游引物序列M30F：5′-ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG-3′；下游引物序列M264R：5′-TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG-3′。
引物由上海杰李生物技术有限公司合成。
1.2.4 流感病毒检测取研磨离心后的组织上清液300 μL，按照Trizol 法提取病毒的 RNA，用流感病毒反转录通用引物Uni-12 (5′-AGCAAAAGCAGG-3′)，并按照AMV 反转录酶使用说明书进行反转录合成cDNA ，以病毒cDNA为模板，用流感病毒鉴定引物 M30F 和 M264R进行 PCR扩增。
待PCR反应结束后，取10 μL PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。
1.2.5 流感病毒空斑测定方法取仔猪肺脏灌洗液进行10倍系列稀释，接种于MDCK细胞6孔板，200 μL /孔，孵育1 h后弃去。
同时加入熔融营养琼脂3mL/孔，待琼脂冷却后，倒置放入37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养72 h，最后结晶紫染液染色，观察空斑情况并计算出病毒滴度。
2 结果2.1 攻毒后仔猪的体温变化攻毒后2 d开始，CIV攻毒组中2头仔猪(A2和A3)开始升温，分别达到40 ℃。
攻毒后5 d，A6仔猪体温高达40.6 ℃；与之相对照的SIV组，体温表现不明显，攻毒后的2 d和3 d分别有2头仔猪体温达到40 ℃(图1)。
2.2 感染CIV和SIV后仔猪排毒和临床症状通过RT-PCR检测，发现攻毒后的3、5、7 d的CIV组(A组)和SIV组(B组)仔猪都能检测到排毒，而在其他器官中均未检测到病毒(数据未出示)。
仔猪在攻毒后临床上均出现食欲不振、活动减少，部分仔猪还出现打喷嚏、流鼻涕、发热等临床症状。
CIV组A3仔猪在攻毒后4 d死亡，并检测到较高含量的病毒，同时出现打喷嚏、食欲下降、消瘦、精神不佳、血便、活动减少等临床症状(表1)。
图1 攻毒后仔猪体温变化情况Fig.1 Body temperature changes of piglets after challenge表1 感染仔猪排毒和临床表现情况Table 1 Virus shedding and appearance of piglets infected with H1N1 CIV and SIV编号№处死时间Day euthanized post-infection鼻拭子病毒检测情况Test of nasal swab357临床表现 Clinical signs A13+N/AN/A食欲不佳,活动减少Depression,less activityA23+N/AN/A攻毒后3 d发烧,食欲下降,打喷嚏,活动减少Fever at day 3 p.i.low appetite,sneezing,less activityA3攻毒后4 d死亡Died at 4 days post-infection+++N/AN/A打喷嚏,食欲下降,消瘦,精神不佳,血便,活动减少Sneezing,low appetite,depression, emaciation, bloody excrement,less activityA45++N/A攻毒后2 d发烧,食欲下降,打喷嚏,活动减少Fever at day 2 p.i.low appetite,sneezing,less activityA57+++打喷嚏,流鼻涕,活动减少Sneezing,runny nose,less activityA67+++打喷嚏,流鼻涕,活动减少Sneezing,runny nose,less activityB13+N/AN/A食欲下降,活动减少Appetite decreases,less activityB23+N/AN/A发烧,食欲下降,打喷嚏,流鼻涕Fever,appetite decreases,sneezing,runny noseB35++N/A食欲下降,活动减少Appetite decreases,less activityB45++N/A食欲下降,活动减少,偶尔打喷嚏Appetite decreases,less activity,sneeze occasionallyB57+++食欲下降,活动减少,偶尔打喷嚏Appetite decreases,less activity,sneeze occasionallyB67+++攻毒后2 d开始发烧,打喷嚏,流鼻涕,活动减少Fever at day 2 p.i.sneezing,runny nose,less activity注：“+”表示RT-PCR检测结果，条带相对亮度；N/A表示数据未获得。