生物信息学常用软件简介-引物设计 PPT课件
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引物设计及测序结果分析精PPT课件
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Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面
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引物设计界面
Original sequence
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
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3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很 低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工 作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足 PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔 的应用前景。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水 平.
❖ PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
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PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模 板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的 机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重 复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
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引物搜索选项设定
引物类型
搜索模式
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
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引物长度
搜索结果
28对引物
引物分值 100分为满分
每对引物的信 息
Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面
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引物设计界面
Original sequence
Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
第20页/共57页
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很 低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工 作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足 PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔 的应用前景。
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水 平.
❖ PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
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PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模 板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的 机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重 复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
第39页/共57页
引物搜索选项设定
引物类型
搜索模式
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
第40页/共57页
引物长度
搜索结果
28对引物
引物分值 100分为满分
每对引物的信 息
引物设计ppt
PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
《引物设计教程》课件
退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
❖ 先调整 premer5 的flie 的 pr源自ferences 的 默认碱基长度
❖ 4、要设计两条链的引物，Sense链和AntiSense链，注意上下游引物： Sense链是上游 引物， Anti- Sense链是下游引物（如何判断）
❖ 5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物 长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基
❖ 其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，
❖ 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。
❖
❖ Tm温度过高过低会出现问题
❖ 7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
❖ 8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何
修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
❖ 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
十条PCR引物的设计原则总述
❖ ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ❖ ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ❖ ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ❖ ④ G+C含量在40%~60%之间。 ❖ ⑤ 碱基要随机分布。 ❖ ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ❖ ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ❖ ⑧ 引物5’端可以修饰。 ❖ ⑨ 引物3’端不可修饰。 ❖ ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
❖ 4、要设计两条链的引物，Sense链和AntiSense链，注意上下游引物： Sense链是上游 引物， Anti- Sense链是下游引物（如何判断）
❖ 5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物 长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基
❖ 其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条 件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，
❖ 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式 Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复 性条件最佳。
❖
❖ Tm温度过高过低会出现问题
❖ 7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的 互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物 间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
❖ 8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何
修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能， 引物3′端不能发生错配。
❖ 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩
第三章4 pcr引物设计 ppt课件
十条PCR引物的设计原则总述
❖ ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ❖ ② 产物不能形成二级结构。（如何避免） ❖ ③ 引物长度一般在15~30碱基之间。（太长和太短？） ❖ ④ G+C含量在40%~60%之间。 ❖ ⑤ 碱基要随机分布。 ❖ ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。（引物二聚合体） ❖ ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ❖ ⑧ 引物5’端可以修饰。 ❖ ⑨ 引物3’端不可修饰。 ❖ ⑩ 引物3’端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计及软件使用.ppt
Primer 3 The Primer Generator AutoPrimer
基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件
引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件 快速筛选二聚体引物软件 用于定点突变的引物设计软件 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
碱基的随机分布
引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC
引物的3’端
与目的位点必须完全同源 与非目的位点避免连续5-6bp的同源
引物设计的原则
引物的Tm值
上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5°C 根据Tm值，确定退火温度
∆G值：DNA双链形成所需要的自由能
GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基
在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”
rfbE
检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦
限制检索范围，将结果 锁定于待查目标
非特异杂交
引物、探针设计
查找基因序列 序列分析
引物、探针设计 特异性验证
GenBank
ClustalX
Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold
BLAST
例:根据大肠杆菌rfbE基因序列， 设计引物和探针
1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列
National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心
有名的在线引物设计程序 在线引物设计程序 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件
基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件
引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件 快速筛选二聚体引物软件 用于定点突变的引物设计软件 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
碱基的随机分布
引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC
引物的3’端
与目的位点必须完全同源 与非目的位点避免连续5-6bp的同源
引物设计的原则
引物的Tm值
上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5°C 根据Tm值，确定退火温度
∆G值：DNA双链形成所需要的自由能
GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基
在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”
rfbE
检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦
限制检索范围，将结果 锁定于待查目标
非特异杂交
引物、探针设计
查找基因序列 序列分析
引物、探针设计 特异性验证
GenBank
ClustalX
Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold
BLAST
例:根据大肠杆菌rfbE基因序列， 设计引物和探针
1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列
National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心
有名的在线引物设计程序 在线引物设计程序 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件
常用生物软件(软件及引物设计总结)
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总结词
NAMD是一款用于大规模并行计算的高 性能分子动力学模拟软件，适用于超大 型生物分子系统的模拟。
ห้องสมุดไป่ตู้VS
详细描述
NAMD采用高效的并行算法和优化的数 据结构，能够在高性能计算集群上快速运 行大规模模拟。它广泛应用于生物医学、 药物设计和材料科学等领域，尤其适用于 模拟蛋白质复合物等大型生物分子的结构 和动力学行为。
SWISS-MODEL
总结词
在线建模工具，适用于预测蛋白质三维结构 。
详细描述
SWISS-MODEL是一个在线建模工具，用于 预测蛋白质的三维结构。它基于模板建模技 术，通过搜索模板库找到与目标序列相似的 已知结构，并利用这些信息构建出目标蛋白 质的结构模型。SWISS-MODEL提供了友好 的用户界面和多种建模选项，方便用户进行
总结词
AutoDock是一款用于分子对接的软件，通过模拟分子间的 相互作用，预测小分子与大分子（如蛋白质）的结合模式。
详细描述
AutoDock使用基于网格的搜索方法，将小分子视为可旋转 和可平移的刚体，通过打分函数评估结合亲和力，并采用遗 传算法进行优化。它广泛应用于药物设计和蛋白质相互作用 研究。
Gromacs
总结词
Gromacs是一款用于分子动力学模拟的软件，通过模拟分子在真实环境中的运 动来研究其结构和功能。
详细描述
Gromacs基于势能面模型，通过求解牛顿方程模拟分子运动轨迹，可以模拟蛋 白质、核酸和脂质等生物大分子的动态行为。它广泛应用于生物物理学、药物 设计和材料科学等领域。
NAMD
Galaxy
总结词
Galaxy是一个基于Web的生物信息学分析平台，提供 了简单易用的界面和强大的数据分析能力。
《引物设计教程》课件
引物长度：通 常为15-30bp， 过长可能导致 非特异性扩增
引物GC含量： 尽量控制在 40-60%，避
免形成二级结 构
引 物 Tm 值 ： 应接近目标序 列 的 Tm 值 ， 以提高扩增效
率
引物3'端：避 免形成发卡结 构，以免影响
扩增效果
引物特异性： 确保引物与目 标序列具有高 度特异性，避 免非特异性扩
增效率和稳定性
引物3'端：避免3'端 出现连续3个或以上 的碱基，以降低错配
率
引物二级结构：使用 软件预测引物二级结 构，避免形成发卡结 构，提高扩增效率
引物特异性：通过 BLAST比对，确保引 物特异性，避免非特
异性扩增
引物浓度：优化引物 浓度，以提高扩增效
率和稳定性
引物纯度：确保引物 纯度，避免污染和降 解，提高扩增效率和
引物GC含量：尽量保持 50%左右，避免过高或 过低
引 物 Tm 值 ： 确 保 引 物 Tm 值在55-65℃之间，以提 高扩增效率
引物特异性：确保引物与 目标序列具有高度特异性， 避免非特异性扩增
引物错配：避免引物内部 错配，以提高扩增效率和 准确性
引物设计软件：可使用 Primer3、OligoT等软 件辅助设计引物
引物设计不当导 致扩增失败
引物设计不当导 致非特异性扩增
引物设计不当导 致扩增效率低
引物设计不当导 致扩增产物长度 不均一
引物设计软件：选择 合适的引物设计软件， 如Primer3、Primer-
BLAST等
引物长度：确保引物 长度在18-25bp之间， 以提高特异性和扩增
效率
引物GC含量：保持 引物GC含量在4060%之间，以提高扩
常用生物信息学软件介绍
常用生物学软件简介1. Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能： a) 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列。
b) 按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物。
c) 对环型DNA片段，设计反向PCR引物。
d) 设计多重PCR引物。
e) 为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现。
f) 分析和评价用其他途径设计的引物是否合理。
g) 同源序列查找，并根据同源区设计引物。
h) 增强了的引物/探针搜寻手段。
设计引物过程中，可以“Lock”每个参数，如Tm 值范围和引物3’端的稳定性等。
i) 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。
网址：/2． Vector NTI Suite是一套功能最全，而且界面最美观，最友好的分子生物学应用软件包。
主要包括四个大型软件，它们分别可以对DNA、RNA、蛋白质分子进行各种分析和操作。
Vector⑴ NTI：作为Vector NTI Suite的核心组成部分，它可以在生物研究的全过程中提供数据组织和序列编辑的软件支持。
Vector NTI 是以一种窗口形式，且支持项目组织的数据库来完成这一功能的；通过这个数据库，可以保存和组织大部分的实验数据，比如：基因结构、载体、序列片断、引物、蛋白质、多肽、电泳Markers和限制性内切酶等。
实际上，该数据库还支持对Vector NTI Suite 中各种小型的绘图和结果展示工具的管理。
Vector NTI 可以按照用户要求设计克隆策略。
用户只需提供克隆载体，外源片断序列，明确载体克隆的大致位置或酶切位点，其它工作由软件完成。
设计结果以图文形式输出到屏幕；最后根据客户定制的条件进行模拟电泳。
Vector NTI 还具有强大的设计和评估PCR引物、测序引物和杂交探针功能。
BioPlot⑵：BioPlot是一个对蛋白质和核酸序列进行各种理化特性分析的综合性工具，它是一种方便的桌面程序。