分子生物学--基因工程与基因体外表达
现代分子生物学重点
现代分子生物学1、DNA重组技术：又称基因工程,是将DNA片段或基因在体外经人工剪接后,按照人们的设计与克隆载体定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。
2、基因组：指某种生物单倍染色体中所含有的基因总数,也就是包含个体生长、发育等一切生命活动所需的遗传信息的整套核酸。
3、功能基因组：又称后基因组，是在基因组计划的基础上建立起来的，它主要研究基因及其所编码蛋白质的结构与功能，指导人们充分准确地利用这些基因的产物。
1、简述分子生物学的基本含义：从广义来讲:分子生物学是从分子水平阐明生命现象和生物学规律的一门新兴的边缘学科。
它主要对蛋白质和核酸等生物大分子结构和功能以及遗传信息的传递过程进行研究。
从狭义来讲：分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，当然其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质与酶的结构和功能的研究2、早期主要有那些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤主要是两个实验：肺炎链球菌转化实验和噬菌体侵染细菌实验步骤：肺炎链球菌转化实验首先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了治病能力，再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无治病能力。
讲经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合在感染小鼠时，实验小鼠都死了，解剖小鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌，推测死细菌的中的某一成分转化源将无治病力的细菌转化成病原细菌。
噬菌体侵染细菌的实验：用分别带有S标记的氨基酸和P标记的核苷酸的细菌培养基培养噬菌体，自带噬菌体中就相应的含有S标记的蛋白质或P标记的核酸，分别用这些噬菌体感染没有被放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA复制周期后发现，子代噬菌体中几乎不含带S标记的蛋白质，但含有30%以上的P标记，这说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA，而不是蛋白质。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
医学分子生物学名词解释-2
1.转录泡（三元复合物）：转录泡是由RNA聚合酶核心酶、DNA模板链以及转录形成的RNA新链三者结合形成的转录复合物。
在转录的延伸阶段，RNA聚合酶使DNA双螺旋解链，暴露出长度约为17bp的局部单链区，因外形酷似泡状结构故称之为转录泡2.3.密码子：mRNA上每 3 个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这 3 个核苷酸称为密码，也叫三联子密码4.摆动假说：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以"摆动"，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。
5.SD序列：位于原核生物起始密码子上游7~12个核苷酸处的保守区，该序列能与16SrRNA的3端互补，促使mRNA与核糖体的结合，与翻译的起始有关。
6.校正tRNA：校正tRNA通过改变反密码子区校正突变。
可分为无义突变的校正RNA和错义突变的校正RNA、移码突变的校正RNA。
7.无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽的突变，叫做无义突变。
8.错义突变：错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化而使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。
9.移码突变：在正常地DNA分子中，碱基缺失或增加非3地倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。
10.可读框：可读框是指mRNA上从起始密码子到终止密码子的一段序列。
11.信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。
12.分子伴侣：一类能帮助其他蛋白质进行正确组装、折叠、转运、介导错误折叠的蛋白质进行降解的蛋白。
当蛋白质折叠时，它们能保护蛋白质分子免受其它蛋白质的干扰。
很多分子伴侣属于热休克蛋白（例如HSP-60），它们在细胞受热时大量合成。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
分子生物学-名词解释
名词解释：核酸构造，性质与功能分子生物学:是从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。
医学分子生物学:是从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。
它主要研究人体生物大分子和大分子体系的构造、功能、相互作用及其同疾病发生、开展的关系。
基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指DNA特定区段，是RNA和蛋白质相关遗传信息的根本存在形式。
大局部生物中构成基因的核酸是DNA, 少数生物〔如RNA病毒〕是RNA。
核酸的一级构造：核酸中核苷酸的排列顺序。
组成DNA分子的脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)的排列顺序。
组成RNA分子的核糖核苷酸(AMP, GMP, UMP, CMP)的排列顺序。
由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。
DNA的一级构造：四种脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)或四种碱基的排列顺序。
DNA三级构造：DNA分子在形成双螺旋构造的根底上，进一步折叠成超螺旋构造(supercoil) (原核细胞)，或在蛋白质的参与下，进展精细的包装(真核细胞)，所形成的空间构造。
超螺旋构造(superhelix 或supercoil)：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋构造。
正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同一样；负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。
构造基因：在基因片段中，贮存着一个特定的转录RNA分子的DNA序列，这段序列决定该RNA分子的一级构造，就称为构造基因。
外显子〔exon):构造基因中在成熟RNA分子中保存的相对应的序列内含子(intron):是指RNA分子剪接时删除局部相对应的构造基因序列基因转录调控序列:与转录相关的、构造基因以外的序列启动子〔promoter):是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，位于构造基因转录起始点的上游，偶见位于转录起始点的下游。
分子生物学-名词解释
名词解释：核酸结构，性质与功能分子生物学:是从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。
医学分子生物学:是从分子水平研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。
它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。
基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指DNA特定区段，是RNA和蛋白质相关遗传信息的基本存在形式。
大部分生物中构成基因的核酸是DNA, 少数生物（如RNA病毒）是RNA。
核酸的一级结构：核酸中核苷酸的排列顺序。
组成DNA分子的脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)的排列顺序。
组成RNA分子的核糖核苷酸(AMP, GMP, UMP, CMP)的排列顺序。
由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。
DNA的一级结构：四种脱氧核糖核苷酸(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)或四种碱基的排列顺序。
DNA三级结构：DNA分子在形成双螺旋结构的基础上，进一步折叠成超螺旋结构(supercoil) (原核细胞)，或在蛋白质的参与下，进行精密的包装(真核细胞)，所形成的空间结构。
超螺旋结构(superhelix 或supercoil)：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。
正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同；负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。
结构基因：在基因片段中，贮存着一个特定的转录RNA分子的DNA序列，这段序列决定该RNA分子的一级结构，就称为结构基因。
外显子（exon):结构基因中在成熟RNA分子中保留的相对应的序列内含子(intron):是指RNA分子剪接时删除部分相对应的结构基因序列基因转录调控序列:与转录相关的、结构基因以外的序列启动子（promoter):是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，位于结构基因转录起始点的上游，偶见位于转录起始点的下游。
《分子生物学》课程教学大纲
《分子生物学》课程教学大纲（理论学时：16学时）使用教材：医学分子生物学（供8年制及7年制临床医学等专业用）分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。
医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。
它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。
作为一门课程，医学分子生物学涵盖了医学各专业学生必须学习的分子生物学基础知识，以及分子生物学在医学领域中形成的专门研究领域及相关知识。
医学分子生物学既要较系统地了解分子生物学的基础理论知识和技术理论知识，同时也要了解分子生物学在医学领域的应用和相关研究进展。
本书共二十三章，包括5个方面内容。
第二章至第十章介绍分子生物学基本知识，主要介绍基因和基因组的基本概念和基本特点，基因组核酸复制与损伤修复、基因表达和功能蛋白形成与降解、基因表达调控、细胞间通讯与信号转导的基本概念和基本理论，细胞增殖与凋亡的相关分子生物学机制。
第十一章至第十三章介绍基因操作的基本知识，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆与表达的相关基本知识和研究策略。
第十四章至第十八章介绍疾病分子生物学机制，介绍了基因和基因组、细胞间通讯和信号与人类健康和疾病之间关系。
第十九章至第二十一章介绍分子生物学理论与技术在医学中应用，包括基因诊断和基因治疗概念与相关研究。
最后两章介绍分子生物学新兴研究领域、生物信息学在基因和蛋白质研究中的应用。
本大纲正是从上述目的出发，在要求学生掌握分子生物学基本知识与基本技术，同时了解分子生物学在医学领域的应用与相关研究。
使学生们在分子水平上研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律，为从事临床医学打下深厚的基础。
绪论一、目的要求了解分子生物学的定义、研究对象和研究内容；分子生物学发展简史；生物遗传物质的发现；现代分子生物学的建立和深入发展；分子生物学与相关学科的关系；分子生物学在医学和生物学中的应用。
分子生物学名词解释
三、名词解释基因工程：在体外应用人工方法进行基因重组，然后把重组的基因导入宿主细胞，进行复制、转录及翻译的过程。
PCR技术：针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。
限制性核酸内切酶：识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
基因工程载体：供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或(和)复制的运载工具。
重组DNA技术：重组DNA技术简单概括为：“分、切、接、转、筛”1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体互补DNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成的与mRNA互补的DNA。
四、问答题1、简述基因工程的基本程序。
基本程序目的基因的获得（DNA片段）(分、切）↓DNA片段与载体基因的连接（体外重组）（接）↓连接产物（重组体）导入宿主细胞（转）↓重组体的扩增、筛选与鉴定（筛）↓目的基因在宿主细胞中的表达↓表达产物的分离纯化2、简述基因工程技术在医学上的应用。
（一）疾病基因的发现与克隆（二）生物制药（三）基因诊断（四）基因治疗（五）遗传病的预防三、名词解释1、受体：（receptor）细胞膜或细胞内的一些天然分子，能够识别和结合有生物活性的化学信号物质（配体，liganal）,从而启动一系列信号转导，最后产生相应的生物学效应。
2、G蛋白：是一种鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白，一般是指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白。
3、MAPK:MAPK 通路是多种促增殖信号在细胞内信号转导的共同通路。
MAPK 的上游激酶MAPKK 或MEK 是一个DSPK，它能使MAPK 分子中的Thr 185 和Tyr 187 磷酸化而使该酶激活。
4、第二信使：细胞内的化学信号----第二信使5、PTK：酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase, PTK ）是一类能催化蛋白质酪氨酸残基(tyr或Y)磷酸化的蛋白激酶，共同特征是所极端具有典型的PTK结构域，该酶可催化自身或底物磷酸化。
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11
Some concerned concepts:
克隆 Cloning
DNA重组 DNA recombination DNA重组技术 DNA recombination technique
分子克隆 Molecular cloning
基因工程 Genetic engineering
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19
一、RE在基因克隆中用于切割DNA
❖ RE (restriction enzyme, restriction endonuclease )----限制性核酸内切酶，限制酶， 能识别DNA双链内特异位点并水解磷酸二酯键， 产生特定末端的酶
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20
Restriction enzyme Functions: 能识别DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键
和操纵子学说，成功破译了遗传密码，阐明了遗
传信息的流向和表达问完整题版课件。ppt
14
三大技术发明
DNA分子的体外切割与连接技术 1970年 Smith, Wilcox 流感嗜血杆菌
(Haemopbilus influenzae) Hind II 1972年 Boyer EcoR I “GAATTC” 1967年 世界上5个实验室几乎同时发现了
allowed, for example, the large scale production of
human insulin for diabetics using E. coli bacteria.
Over 3000 restriction enzymes have been studied
in detail, and more than 600 of these are available
DNA ligase 1970年 T4 DNA ligase
基因工程载体的使用：plasmid, phage, viruses
大肠杆菌转化体系的建完整立版课件-p-pt--复制工厂
15
1978年Nobel 医学与生理学奖
The Nobel Prize in Medicine was awarded, in 1978,
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12
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13
三大理论基础
40年代，O.T. Avery等通过肺炎链球菌转化实验 发现遗传物质的携带者是DNA而不是蛋白质
1953年，Watson 和Crick揭示了DNA分子的双螺 旋结构模型和半保留复制原理，解决了基因的自 我复制和传递的过程。
50年代末到60年代初，相继提出了“中心法则”
3. 载体 (vectors)
4. 宿主细胞 (host cells)
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4
Main contents
基本概念及背景 工具酶
DNA载体 基因克隆过程
真核细胞基因转染 基因改造
克隆基因表达
电子克隆完整版课件ppt
5
For Example
如何从植物中克隆法呢基焦磷酸合酶(FPS)? 1. 查资料认识FPS 2. 设计实验方案 3. 可行性分析
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第一节 基因克隆是利用工具酶进行操作
❖ 工具酶(Tool enzymes )----
用于对DNA分子进行定点切割、连接、扩增、 标记等操作的特殊酶类，已被纯化并商品化进 行应用
一、 限制酶 (RE , restriction endonuclease )
二、其他工具酶 (other tool enzymes)
基因特异性引物
AAAAAA3’ TTTTTTT-接头 Oligo dT接头
3’ Full RACE原理图
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9
(1) 5’ (2) 5’ (3)
5’ Full RACE原理图
未知区域
Target mRNA 已知序列
AAAAAAAA-----
P
逆转录
5’-端磷酸化RT-Primer
未知区域
commercially and are routinely used for DNA
modification and manipulation in laboratories.
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16
完整版课件ppt
17
18
DNA ligase repairing chromosomal damage. ligase I, DNA, ATP-dependent
全国高等医药教材建设研究会 卫生部规划教材 全国高等学校教材
供七、八年制临床医学等专业用
医学分子生物学 Medical Molecular Biology
主编 冯作化 人民卫生出版社 2005年8月第一版
课件制作：吴耀生(版权所有)
广西医科大学基础医学院
生物化学与分子生物学教研室 2008.10
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to Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton
Smith for the discovery of restriction
endonucleases. Their discovery lead to the
development of recombinant DNA technology that
P RNA分解
AAAAAAAA-----
未知区域 未知区域
P
用RNA ligase进行环化或形成首尾连接物
S2 S1
A1 A2
5’-端磷酸化RT primer部位
(4) 1st PCR primers件npdpPt CR
10
包含未知的5‘上游区域的扩增产物
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6
For Example
完整版课件ppt
7
FPS 克隆： RT-PCR， 3'-RACE， 5'-RACE
改进的异硫氰酸胍一步法提取三七根部总RNA
RT-PCR扩增fps部分保守序列
3’-RACE 及克隆测序
5’-RACE 及克隆测序
序列完整拼版课接件ppt
8
mRNA: 5’ cDNA:
1
第十三章
基因工程与基因体外表达
Gene Engineering and Gene Expression
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2
目的与意义
1.获得感兴趣的目的基因
2.研究基因结构特征
3.表达基因产物
4.研究基因功能
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3
基本要素
1. 目的基因 (target genes)
2. 工具酶 (tool enzymes)