第二代测序原理及过程 共20页PPT资料
二代测序原理
二代测序原理
二代测序是一种新的整合技术，由基因组学和分析软件组合而成，可以帮助科学家从
生物样本中准确、快速地获取完整的基因组序列。
它是由美国生物技术公司Illumina Inc.推出的，全面改变了以前的测序方法，使基因数据提取更加便捷。
二代测序使用分析得到的核苷酸序列，以比以前更大的节省时间、金钱和开发空间，
让基因组学技术得以普及化。
它可以利用大量微小的DNA片段，采用高通量DNA测序概念，高效地扩增和检测DNA片段，在芯片或者介质上大量分解DNA，得到极短的核苷酸片段序列，最后利用计算机合成完整的基因组序列。
二代测序技术有很多优势，如果比较传统的Sanger测序技术，它有很大的改善，可
以有效减少测序噪声、提升测序速度、降低测序成本，而且相较费劲的体外扩增步骤，二
代测序技术可以大大减少实验环节，大大加快实验进度。
此外，这种技术还改变了人们认知生物样本的方式，使基因的检测从几个小时可以达
到数小时，而不需要几天的时间；它也可以不仅仅在基因变异和转录组表达上有苛刻的要求，还可以进行高维度基因组测序，用于基因组研究、变异检测，以及表达分析、融合分
析等。
总之，二代测序技术为基因组学提供了新的机制，大大改变了现今的生物学研究，推
动了研究的进展，因而被公认为是基因组学的一种新技术。
二代测序技术原理
二代测序技术原理
二代测序技术是利用DNA分子在体外进行扩增复制，再将扩增产物通过高通量测序平台进行测序的一种技术。
首先，将待测DNA样本进行多轮PCR扩增。
PCR（聚合酶链反应）是通过引物将DNA分子不断复制扩增的过程，使得DNA的数量大幅增加。
接着，将扩增产物构建成文库。
文库是将扩增产物连接到适当的载体上，以便后续的高通量测序。
然后，将文库进行片段化处理。
片段化是将文库中的DNA分子随机断裂成短片段，通常为几百个碱基对。
接下来，将片段化的DNA片段连接到测序芯片上。
测序芯片上覆盖有成千上万个微小反应室，每个反应室中都含有不同的DNA片段。
之后，会进行聚合和将DNA合成反应。
在这个过程中，DNA 片段会与测序芯片上的引物配对，引物以及DNA聚合酶和碱基等反应物会被加入，以使得DNA的合成完成。
最后，测序芯片会被放入高通量测序仪中进行测序。
高通量测序仪会给每个反应室施加激光，激活DNA合成过程中所用的荧光标记物。
这样，测序仪会记录下每个反应室中所发出的荧光信号，以确定DNA序列。
整个过程完成后，测序仪会输出大量的原始数据。
这些数据会经过生物信息学分析，将碱基序列信息从原始数据中提取出来，并进行测序结果的拼接和比对，从而得到最终的DNA序列信息。
总的来说，二代测序技术通过多轮PCR扩增、文库构建、片
段化、测序芯片上的引物配对和高通量测序等步骤，实现了对DNA样本进行快速高效的测序。
第二代DNA测序技术
Illuumina测序系统采用的是桥式PCR扩增
• （3）测序：加入测序试剂，在合成连结合一个碱基后，洗脱掉 游离的dNTP，然后在检测荧光信号后加入化学试剂淬灭荧光信 号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以此为一个循环，重复这个循 环即可测出该片段序列。
第二代DNA测序技术简介
• 第二代DNA测序技术包括：Roche公司的454技术、illumina公司的 Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术
• 核心思想：边合成边测序 • 特点：读长短、通量高，成本低、测序快
• Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台 测序原理：焦磷酸测序法—4种酶催化的同一反应体系中的酶级联 化学发光反应 • 焦磷酸测序法反应体系：1个特异性的测序引物和单链DNA模板，
• （4）测序：采用焦磷酸测序法，每个含有磁珠的小孔都可以测 出其中一个片段的序列。
• Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器 • 测序原理：类似Sanger测序法，dNTP的3’-OH被化学方法所保护，并带有碱
基特异荧光标记，因而每次只能添加一个dNTP，放出一个荧光信号。
454测序流程• （1）DNA制备：将待测DNA打断成300-800bp长的小片段， 末端修复后在片段两端加上不同的接头，变性处理回收单链DNA。
• （2）体外DNA扩增：454系统采用的是乳化PCR的方法进行扩增。
• （3）富集固定：将含有DNA片段的磁珠富集起来，并将这些磁珠 置于一种PTP平板中的特制小孔中，每个孔只能容纳一个磁珠。
（1）第一次连接引物n-1比第一轮错开一位，所以此次得到0，1位碱基对的颜 色信息
（2）化学处理后，第二次连接反应得到的是5，6位碱基对的颜色信息，第三 次是10，11位碱基对的颜色信息……
《二代测序简介》PPT课件
陈竺，日本血吸虫基因组
.
10
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
• 宏基因组学（Metagenomics） • 泛基因组学（Pangenomics）
.
3
3
Key Genomics Technologies
1975 - Southern DNA hybridization technique
1977 - Sanger’s chain-termination and Maxam、Gilbert’s
.
6
Limitation of 1st Gen Sequencer
Throughput
Time-consuming separation of chainterminated fragments
Hard to produce massively parallel system based electrophoretic separation
Template DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead)
Thermocyle to amplify (forward primer is biotinylated)
– Asymetric Adaptors ligated (one biotinylated)
DNA第2代测序技术ppt课件
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 孟德尔于1866年发表了论文《植物杂交试验》，首次提 出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细 胞里的遗传因子控制的。 • 但是，孟德尔的这一重要理论当时未能收到重视，直到 1900年，狄· 弗利斯﹑柴马克和柯伦斯三人才同时发现。 • 1900年孟德尔遗传规律的重新发现，被公认为遗传学建 立和发展的一年，并于1906年将遗传学作为一个学科的 名称。
DNA第2代测序技术ppt课件
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
1.6 第2代测序技术的前景
• 大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的 芯片测序技术。 • 新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。 • 但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封 闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变 异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系 统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上 高于芯片技术。
高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达 谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
• 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行 了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据 显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息 通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’ 端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。454测序技术流程
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A) 的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数 目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。 也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷 酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
二代测序技术原理及流程
二代测序技术原理及流程
二代测序技术是21世纪基因组研究的重要工具，它可以非常快速、高效地测序大量基因组DNA。
它的出现大大改变了基因组学研究的方式，为基因组学研究开辟了新的领域。
二代测序技术的基本原理是使用DNA分子的多股结构，将DNA片段分离成多条线索，然后将其与一种可以识别DNA序列的标签探针结合起来，最终形成一种测序碱基组合。
二代测序技术的流程主要包括基因组DNA的提取、断裂、测序和分析四个步骤。
首先，基因组DNA需要从细胞中提取出来，然后使用专门的断裂试剂将基因组DNA分解成许多小的片段，这些片段称为“测序库”，然后将测序库及其相关的标签探针混合在一起，最后将混合物放入测序仪中进行测序，从而获得碱基组合。
最后，可以使用计算机软件对测序结果进行分析，从而获得基因组DNA的完整序列。
二代测序技术是一种革命性的技术，它可以大大提高基因组学研究的效率，为科学研究开辟新的可能性。
第二代测序原理
第二代测序原理第二代测序技术是一种高通量测序技术，它的原理是基于DNA合成和光学信号检测。
在第二代测序技术中，DNA样本首先被打断成较小的片段，然后这些片段被连接到载体上，形成一个DNA文库。
接下来，文库中的DNA片段会通过PCR扩增，产生大量的同一片段序列。
然后，这些DNA片段会被固定在固相载体表面，并进行测序反应。
在测序反应中，DNA片段会被逐一合成，每次合成一个碱基。
在每次合成过程中，会释放出荧光信号，这个信号会被检测器捕获并记录下来。
通过记录下的荧光信号，就可以确定DNA片段的序列。
这种高通量的测序技术可以同时测序成千上万个DNA片段，大大提高了测序效率。
除了高通量之外，第二代测序技术还具有快速、低成本、高灵敏度等优点。
由于其快速高效的特点，第二代测序技术被广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
它为科学家们提供了一个强大的工具，帮助他们更好地理解基因组的结构和功能。
然而，第二代测序技术也存在一些局限性。
例如，由于测序反应中使用的荧光标记物会随着时间的推移而褪色，导致测序结果的准确性下降。
此外，第二代测序技术在测序过程中会产生大量的数据，需要强大的计算和存储设备来处理和存储这些数据。
为了克服这些局限性，科学家们不断改进第二代测序技术，提高其测序准确性和效率。
例如，引入了新的荧光标记物，提高了测序反应的稳定性；开发了新的数据分析算法，加快了数据处理的速度。
这些改进不断推动着第二代测序技术的发展，使其在基因组学研究中发挥着越来越重要的作用。
综上所述，第二代测序技术是一种高通量、快速、低成本的测序技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断改进和完善，相信第二代测序技术将在基因组学研究中发挥越来越重要的作用，为人类健康和生命科学的发展做出更大的贡献。
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The Roche/454 FLX
454/enablingtechnology/the-system.asp
The method used by the Roche/454 sequencer to amplify single-stranded DNA copies from a fragment library on agarose beads. A mixture of DNA fragments with agarose beads containing complementary oligonucleotides to the adapters at the fragment ends are mixed in an approximately 1:1 ratio. The mixture is encapsulated by vigorous vortexing into aqueous micelles that contain PCR reactants surrounded by oil and pipetted into a 96-well microtiter plate for PCR amplification. The resulting beads are decorated with approximately 1 million copies of the original single-stranded fragment, which provides sufficient signal strength during the pyrosequencing reaction that follows to detect and record nucleotide incorporation events. sstDNA, singlestranded template DNA.
marketing.appliedbiosystems/images/Product/Solid Knowledge/flash/102207/solid.html
The ligase-mediated sequencing approach of the Applied Biosystems SOLiD sequencer. In a manner similar to Roche/454 emulsion PCR amplification, DNA fragments for SOLiD sequencing are amplified on the surfaces of 1-μm magnetic beads to provide sufficient signal during the sequencing reactions, and are then deposited onto a flow cell slide. Ligase-mediated sequencing begins by annealing a primerl histogram of signal intensities for negative and positive flows
The Illumina/ Solexa Genome Analyzer
illumina/pages.ilmn?ID=203
The Illumina sequencing-by-synthesis approach. Cluster strands created by bridge amplification are primed and all four fluorescently labeled, 3-OH blocked nucleotides are
The sequencing instrument consists of the following major subsystems: a fluidic assembly (A) a flow chamber that includes the well-containing fibre optic slide (B) a CCD camera-based imaging assembly (C) a computer that provides the necessary user interface and instrument control.
the 3-OH blocking groups are added to the flow cell, which prepares the cluster strands for another round of fluorescent nucleotide incorporation
The Applied Biosystems SOLiDTM
added to the flow cell with DNA polymerase. The cluster strands are extended by one nucleotide.
Following the incorporation step, the unused nucleotides and DNA polymerase molecules are washed away, a scan buffer is added to the flow cell, and the optics system scans each lane of the flow cell by imaging units called tiles. Once imaging is completed, chemicals that effect cleavage of the fluorescent labels and