浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略
浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施
生长 可证 明该 细胞受 到 了细菌 的污 染 。 １２ 支原 体 污 染 ． 支 原 体 污 染 不 能 用 肉眼 或 光 学显 微镜 检查 细胞观 察 出来 ， 带有 一 定的 隐蔽 性 ， 易被 人们忽 视 。 当细胞 被支 原体 污染 后 ， 细胞营 养 液可 能毫无 变 化 ，短 期 内细胞 没 有 明显 的病理 变
性 作用 ，因此 特 别要注 意不 同的细胞 培养 的特 点
培养 基上培 养 ， 如果见 到培养 基上 有霉 菌 生长 ， 也 可 以判 断该 细胞 受到霉 菌污 染 。霉 菌 污染 可 以使
细胞变 形 、 脱落 。霉菌孢 子对 环境 的耐 受 力很强 ，
和 对抗 生素 耐受程 度 的不 同。在对 具 体 的细胞选
种 营养 成分 隐性污 染细菌 没有 被检 测 出来所 造 成 的。 即使在 细胞培 养液 中加 入 了抗菌 素 ， 得细 菌 使
繁殖 处于 抑制状 态 ， 细胞 生长 不受 明显 影 响， 易 不
即淘汰 该细 胞和 培养 液 。 外 ， 此 支原 体污 染还可 用
荧光 染色法 ［ 和相 差显 微镜 观察 法 ［ 检测方 法 。 ｓ 等 １３ 霉菌 污染 ． 霉 菌污 染和 细 菌污 染 比较 相似 ， 都 可 以 由无 菌操 作环 境差 或者 器材 等 消毒 不彻底 造 成 。霉菌 污染 经 常发 生在潮 湿 的季节 或 者潮湿 的操 作环境 。可 以通 过 肉眼观 察细 胞 生长和 培养 基 培养 的方 法来检 测 霉菌 污染 。霉 菌短 期 内不会 引起 营 养液 的浑浊 ，但 是在 细胞 瓶壁 可 以见 到 明
广 东畜牧兽 医科技
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经验交流 ・９ ４・
细胞培养常见问题的原因及对策
细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
细胞培养中的污染问题与对策
细胞培养中的污染问题与对策细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究细胞的生长、分化和功能。
然而，在进行细胞培养的过程中，污染是一个不可忽视的问题。
污染源可以来自外部环境、工作环境或实验操作不当。
对于细胞培养的研究结果的准确性和有效性而言，解决污染问题的对策至关重要。
首先，污染问题可能来自实验室环境以及操作者自身。
实验室环境中存在的微生物污染可能会导致细胞培养的受损。
因此，保持实验室环境的清洁是非常重要的。
定期进行实验室卫生和表面消毒是降低微生物污染的有效措施。
此外，操作者在进行细胞培养时需要严格遵守无菌操作规程，以减少自身的污染对细胞的影响。
操作者需要穿戴合适的实验室清洁工作服、手套和口罩，并在操作过程中注意避免直接接触细胞培养物。
其次，细胞培养中使用的培养基和试剂也是潜在的污染源。
为了避免污染，选择高纯度的培养基和试剂是至关重要的。
购买来自可靠供应商的培养基和试剂，严格遵循使用说明书的指导，可以减少产品本身的污染。
此外，在实验进行过程中，避免将培养基和试剂暴露在不洁的环境中，并妥善保存这些试剂，以防止其受到污染。
另外，细胞培养过程中的传代也是容易导致污染的环节。
细胞传代是保持细胞生长的关键步骤，但传代时的细胞污染可能会导致细胞功能和表型的变化。
为了避免细胞污染，应该定期对细胞进行鉴定和检测，特别是使用发展中的分子标识技术。
这些技术可以帮助确定细胞是否保持纯种，以及是否受到污染。
此外，定期保存冻存品库并且用来传代的细胞不要超过特定的传代次数，以保持细胞的良好生长状态。
另一个需要关注的污染问题是培养器具的污染。
培养器具包括培养皿、培养瓶、移液器等。
这些器具在使用之前需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌状态。
在使用过程中，需要注意避免直接接触器具内外部分，以减少污染的可能性。
同时，定期更换使用的培养器具也是非常重要的，以防止积累污染物。
最后，除了以上提到的对策，培养载体选择也可以在一定程度上减少细胞培养时的污染问题。
细胞培养过程中的污染及预防
细胞培养过程中的污染及预防由于环境条件没有控制好和操作不当等原因，细胞培养中常可发生细菌和霉菌的污染。
常见污染的细菌有：革兰氏阴性菌，如大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰氏阳性菌有葡萄球菌等。
真菌污染在炎热潮湿的季节常可发生，如烟曲霉菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。
霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长或杀死细胞，镜下可见胞浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃从壁上脱落。
对于污染的观察，霉菌污染易于发现，肉眼可见白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。
而细菌污染较重时可见培养基上清浑浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行培养及培养加以确定。
目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞的死亡，使其作为科研的原料不可再用，造成人力、财力和实践的损失，因此一定要尽量避免污染的发生。
一般可从以下三个途径来控制污染的发生：一、细胞培养的室内环境细胞培养室内应相对封闭，洁净无尘，设有缓冲间。
细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，定期消毒。
专用物品只在培养间内使用，不得带出培养间。
培养间和缓冲间每周彻底清洁消毒一次。
二、细胞培养的试剂和用品工作中要特别注意防止培养液和血清的污染。
培养细胞所用的血清必须储存于-20至-70℃，但也不能超过一个月，解冻时在4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中要规则摇晃均匀，使温度与成分均一，这样可以减少沉淀。
最好不要直接在37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
三、无菌操作和对实验人员的要求有很多污染的发生都与操作不当有关，而细胞培养试验的操作应是严格的无菌操作。
首先试验进行前，无菌操作台面、废液缸及实验用品均应用紫外灯照射30-60分钟灭菌；以75%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后方可开始实验操作。
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
细胞培养中的微生物污染预防与处理
细胞培养中的微生物污染预防与处理细胞培养作为一种重要的实验手段，在生物医学研究领域中得到广泛应用。
然而，在细胞培养的过程中，微生物污染往往成为一个严重的问题，可能对实验结果产生不良影响甚至导致实验结果的无效化。
因此，预防和处理细胞培养中的微生物污染是细胞培养实验中不可或缺的一环。
首先，预防细胞培养中的微生物污染至关重要。
以下是一些有效的预防措施：1. 严格执行无菌操作：细胞培养实验中，无菌操作是最基本也是最重要的环节。
在进行培养操作前，实验人员应该经过相关的培训和指导，了解无菌操作的正确步骤和技巧。
例如，在实验操作前经常更换手套、使用经过有效消毒的培养器具和培养基等。
2. 经常清洁和消毒实验环境：实验室环境和设备的清洁和消毒是预防微生物污染的另一个重要方面。
实验室的工作台面、实验室衣物、培养箱、孵化器等都需要经常进行清洁和消毒，以减少微生物的存在和传播。
3. 控制空气中的微生物：空气中的微生物往往是细胞培养中的污染源之一。
为了降低空气污染带来的风险，实验室应该配备高效过滤器的实验室通风设备，定期更换过滤器。
此外，实验室应该设置限制进出实验室的措施，例如，安装空气帘或者设置冲洗区域。
4. 识别和处理污染源：在细胞培养中排查和识别潜在的污染源是很重要的。
实验人员应经常检查培养器具、培养基和试剂等是否存在污染，一旦发现污染，应及时处理。
处理污染源的方法包括更换受污染的培养器具、重新配制新的培养基或试剂等。
其次，当细胞培养中发生微生物污染时，采取适当的处理方法也是至关重要的。
1. 立即停止受污染的实验：一旦发现细胞培养被污染，实验人员应立即停止受污染的实验，并将受污染的培养器具和培养基等隔离处理，以防止污染的进一步传播。
2. 进行污染源检查：在处理微生物污染的同时，必须找出污染源，并加以处理。
通过对培养器具、培养基和试剂等进行检查，可以找到导致污染的原因，进而采取相应的措施。
3. 清洁和消毒工作环境：在处理污染源的同时，必须对实验室的工作环境进行清洁和消毒。
细胞培养中的常见问题解决方法
细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
细胞培养技术中常见污染问题的解决方法
细胞培养技术中常见污染问题的解决方法细胞培养技术在生物医学研究领域扮演着重要的角色。
然而，细胞培养过程中常常会出现一些污染问题，严重影响实验结果的可靠性和重复性。
本文将探讨细胞培养技术中常见污染问题的解决方法。
一、细菌污染在细胞培养过程中，细胞培养器皿、培养基和实验室环境中都可能存在细菌污染的问题。
为了解决这个问题，可以采取一些预防措施。
首先，必须定期清洗和消毒培养器皿，以确保其表面的无菌。
其次，使用高品质和无菌的培养基是防止细菌污染的关键。
培养基应在严格无菌条件下配制，并在每次使用前进行相关的质检。
此外，实验室环境的洁净度也需要保持，经常进行清洁和消毒，减少细菌的滋生和传播。
二、真菌污染真菌污染是细胞培养中常见的问题之一，尤其在湿度高的环境下更容易发生。
为了避免真菌污染，可以在实验室中合理控制湿度，并保持培养器皿和培养基的干燥。
此外，使用抗真菌剂可以有效地减少真菌感染的风险。
对于一些特定的细胞系，可以对细胞培养器皿进行预处理，如用乙醇或己硝酸等消毒剂进行表面处理，以提高培养器皿的抗真菌能力。
三、交叉污染细胞系的交叉污染是实验室中常见的问题。
它可能是由于不慎携带其他细胞系的污染物，或是在培养中不同细胞系之间的相互感染所致。
为了防止交叉污染，可以采取一些措施。
首先，实验人员在操作细胞系之前必须养成良好的个人卫生习惯，包括洗手、戴手套等。
其次，不同细胞系之间要严格分开培养，避免接触。
此外，可以对新获得的细胞系进行鉴定，使用PCR等方法进行验证，确保其纯度。
四、内源性污染内源性污染是指细胞系自身产生的污染物。
它可能是由细胞自身分泌的代谢产物、去胎氧核糖核酸或细胞死亡引起的。
为了解决这个问题，可以采取以下措施。
首先，要定期更换培养基和培养器皿，及时清除废液和死细胞。
其次，对细胞进行经常性的鉴定，确保其活性和稳定性。
同时，培养温度、培养时间等因素也需要加以调整，以减少内源性污染的发生。
综上所述，细胞培养技术中常见的污染问题是可以通过一系列的控制措施来解决的。
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摘要动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。
近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。
本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。
关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略目录摘要 (I)1引言 (1)2基础理论概述 (1)2.1细胞培养的概念 (1)2.2原代细胞培养的概念 (1)2.3传代细胞培养 (2)3影响细胞体外培养的因素 (2)3.1细胞分离方法 (2)3.1.1直接分离法 (3)3.1.2酶消化法 (3)3.2细胞培养温度 (3)3.3细胞培养基的成分 (3)3.3.1天然培养基 (3)3.3.2合成培养基 (3)3.4接种密度 (4)3.5培养基的pH值 (4)3.6细胞的冻存与复苏 (4)3.6.1细胞冻存 (4)3.6.2细胞复苏 (5)4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5)4.1无菌室的彻底消毒 (5)4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6)4.2.1清洗 (6)4.2.2消毒灭菌 (6)4.3培养试剂的分装与保存 (7)4.4对操作者的要求 (7)5结语 (8)参考文献 (9)致谢 (10)浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略1引言细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。
近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。
2基础理论概述2.1细胞培养的概念细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。
2.2原代细胞培养的概念原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。
培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。
(1)单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。
(2)悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分离细胞，低速500-1000r/min，离心5-10min即可。
培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液中，细胞就能增殖。
2.3传代细胞培养传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。
根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。
这些细胞一般可顺利传40-50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系／株。
一般细胞原代培养1-4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。
在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。
传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。
人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的儿童2-10代。
传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。
(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用ＥＤＴＡ溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。
过滤除菌后小量分装，于-20℃保存。
消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的ＥＤＴＡ溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37℃作用3-5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。
(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。
根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积3影响细胞体外培养的因素3.1细胞分离方法细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。
3.1.1直接分离法该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。
3.1.2酶消化法多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。
胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。
3.2细胞培养温度不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35-37℃，鸟类细胞培养温度为38.5℃，鼠类细胞为34℃。
一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。
因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。
在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37℃、CO2体积分数为5%。
3.3细胞培养基的成分培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。
培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。
3.3.1天然培养基最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。
血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。
与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。
质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。
血清的体积分数要控制在5%-20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。
一般将血清保存于-20℃以下，时间不易过长。
3.3.2合成培养基合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。
内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。
单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。
迄今为止，人工合成的培养基已有多种，如RPMI-1640、Eagle’s MEM、DMEM等，其主要差别在于氨基酸、维生素、无机盐和能源物质的组成及含量不同。
一般认为RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用；Eagle’s MEM适合于细胞株的传代培养；DMEM有利于细胞的分裂增殖；Ham’s F12能促进细胞的分化。
也有学者将不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。
培养液中的抗生素是青霉素和链霉素。
此外，卡那霉素、新霉素、两性霉素、氯霉素等都可以防止细胞培养过程中细菌和真菌的感染。
3.4接种密度一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，细胞密度过大时，养分不足，使细胞迅速老化；而密度过小时，不利于细胞单层的形成。
在传代培养中，细胞的密度取决于传代的时间。
一般分瓶的稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。
在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。
3.5培养基的pH值在培养动物细胞时，不同种动物或是同一种动物的不同部位对pH值的要求各不相同。
一般认为，动物细胞培养基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱碱性。
培养过程中pH值低于6.8时对细胞生长会有抑制作用，细胞生长缓慢；而当pH高于7.6时则细胞不能生长，这可能是由于空气的接触而导致培养基中的营养成分被氧化所致。
3.6细胞的冻存与复苏细胞冻存和复苏的基本原则是“慢冻快融”，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质都能提高细胞膜对水的通透性。
缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
3.6.1细胞冻存传代培养的细胞，如果暂时不用，可以冷冻保存。
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞后用于实验。
而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂至终体积分数5％。
15％的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
标准冷冻速度开始为-1℃／min或者-2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。
3.6.2细胞复苏复苏细胞的原则为快速解冻，从液氮中取出细胞冻存管之前应准备好38℃的温水，冻存管取出后用镊子夹住顶端迅速放入温水中，结束后还要在75％酒精中清洗几次，除去透明过程中染上的杂质。
为缩短透明时间，可将标本放在烘干箱或灯光下加热，透明时间长短根据标本大小、多少和环境温度而定。
冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关。
二甲基亚砜（DMSO）是一种具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂，其常用体积分数为10％～20％，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别。
4细胞实验室无菌环境的防控策略目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞死亡，从而造成人力、财力和时间的损失，有时还可能造成特殊材料的不可再用。
因此，在做细胞实验时，一定要尽力避免污染的发生。
4.1无菌室的彻底消毒无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。