T细胞体外培养
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
CCK8法与其他检测法的优势
实验材料
小鼠、75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4） 红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液 、胎牛血清、刀豆蛋白A、CCK8检测试剂 盒
眼科剪刀、镊子、酒精棉球、注射器枕芯、 无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管、微量 移液器、枪头、血球计数板、计数器
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
96孔板布局
PBS孔
调零孔 未刺激组 刺激组
K8检测：培养结束后，每孔（调零组、未 刺激组、刺激组）加入10 μL CCK8溶液，将 培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测 定在450nm处吸光度。
优点：简便易行，仪器简单 缺点：受实验者主观因素影响，准确性和重复
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
快速体外分离、长期培养人Th17细胞
快速体外分离、长期培养人Th17细胞方法1.Subject全血2.CD4+T细胞浓缩采用RosetteSep（StemCell Technologies，Canada）进行阴性选择得到浓缩CD4+T细胞。
建立标准密度梯度离心，分离出淋巴细胞3.CD4+T细胞刺激将浓缩的CD4+T细胞悬浮在RPMI1640培养基中（Sigma），包含青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺，HEPES缓冲液和10%小牛血清（R10），浓度为1×106个细胞/ ml.含 3×106个细胞的3mlR10，在15ml Falcon管中，用每毫升含4μL（1mg/ml）PMA和2μL（1mg/ml）伊沃诺霉素（AG Scientific，San Diego，CA）的细胞溶液刺激。
继而加入总量3μL的包含CD49d （1mg/ml）和CD28（0.5mg/ml）的共刺激抗体（BD Biosciences）。
随后细胞在37℃、5%CO2条件下孵化3个半小时。
阴性对照采用相似方法，但用R10替换PMA和伊沃诺霉素。
为了用细胞内细胞因子标记法测量IL-17产量，浓缩的CD4+T细胞用10μL Brefeldin A（1mg/ml）刺激。
4.IL-17捕捉复合物的准备IL-17捕捉复合物由2个生物素标记的抗体组成，2个抗体通过一个抗生物素蛋白分子连接。
直接连在T细胞表面CD45分子的抗体与IL-17抗体配对。
2μL生物素标记的CD45抗体（clone H130）（Caltag，Invirtrogen，CA）和20μL生物素标记的IL-17抗体（0.5mg/ml）（clone：eBio64DEC17）（ebiosciences，CA）混合加入eppendorf管，并彻底漩涡。
然后，加入2μL未作标记的5mg/ml的生物素（Invitrogen，CA），并立即充分混匀。
复合物在室温下孵化10分钟，使用前再次漩涡。
5.IL-17体外捕获分析被刺激过的细胞用含有2%小牛血清（2%FCS/PBS）的冰冻PBS（Cellgro ，Mediatech，V A）,冲洗，以500×克离心10分钟成小球，上清液被完全吸出。
CD4+T细胞体外刺激制备流程
CD4+T细胞体外刺激制备流程1. 按照小鼠或人源CD4+ T 细胞分离kit (Thermo) 说明书分离得到CD4+ T 细胞。
2. 取所需体积的PBS，按照5 μg/ml的终浓度加入Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置4h，吸掉抗体悬液，加入500 μl 1% BSA（PBS 配置）室温封闭30 min，封闭结束加入500 μl PBS洗孔一次。
注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。
3．将分离得到的CD4+ T按照浓度5´105 cell/ml重悬在完全T 细胞培养基中（1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 50 mM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2），将细胞加入步骤2中包被处理好的平板，2 ml每孔（1´106 cell/well），然后放入37℃ CO2培养箱刺激培养48h。
细胞在刺激24h后体积略微增大，进入活化状态，刺激48h后可进行病毒感染。
四. CD4+ T细胞感染（以过表达GFP的病毒为例）1. 收集活化好的CD4+ T细胞，400g离心5min。
用T细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。
2. 另取一Anti-mouse CD3e和Anti-mouse CD28抗体包被好的24孔板，每孔加入2-5´105的细胞（若为96孔板，加入2´104细胞/孔）。
若考虑长期表达目的基因，按MOI=50-100加入T细胞专用逆转录病毒mTRv-GFP或者hTRv-GFP，注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按MOI=500-1000加入悬浮细胞专用腺病毒Ads-GFP。
体外小鼠t细胞耗竭
体外小鼠t细胞耗竭
体外小鼠T细胞耗竭是指小鼠体外培养的T细胞在一段时间内
失去活力和功能的现象。
这种现象可能由多种因素引起，包括培养
条件、细胞状态、细胞因子等因素。
以下是对这一问题的多角度全
面回答：
1. 培养条件，体外培养的T细胞需要适当的营养物质、温度、
气体和培养基等条件来维持其生长和功能。
如果培养条件不合适，
如pH值偏高或偏低、温度不稳定、营养物质不足等，都可能导致T
细胞的耗竭。
2. 细胞状态，体外培养的T细胞可能会因为过度分化、细胞老
化或细胞死亡等原因而失去活力。
这可能与培养时间过长、细胞密
度过高或过低等因素有关。
3. 细胞因子，T细胞的功能和活力受多种细胞因子的调控，如
IL-2、IL-7等。
如果培养过程中这些细胞因子的浓度不足或过高，
都可能影响T细胞的功能和活力，导致耗竭现象的发生。
4. 免疫调节，体外培养的T细胞可能受到免疫调节因子的影响，
如PD-1、CTLA-4等，这些因子可能在体外培养条件下影响T细胞的活力和功能。
5. 应激反应，细胞在体外培养过程中可能受到各种应激因素的影响，如氧化应激、细胞因子刺激等，这些应激因素可能导致T细胞的耗竭。
总的来说，体外小鼠T细胞的耗竭可能是由多种因素共同作用所致，需要综合考虑培养条件、细胞状态、细胞因子、免疫调节和应激反应等因素，以寻找合适的解决方法来维持T细胞的活力和功能。
希望这些信息能够帮助你更全面地理解体外小鼠T细胞耗竭的问题。
体外扩增培养的nkinkt细胞及...
前言NK细胞（natural killer），即自然杀伤细胞,是机体固有免疫的组成细胞。
NK细胞主要来源于骨髓，在骨髓微环境中逐渐发育成熟，分布至外周血中。
当病毒感染细胞、寄生虫侵入等感染因素发生及自身细胞衰老、恶变时，NK细胞可以识别这些异常的细胞，通过穿孔素/颗粒酶途径直接裂解异常细胞，或者通过Fas-FasL、激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)途径达到杀伤靶细胞的目的。
iNKT细胞，即恒定自然杀伤T细胞（invariant natural killer T cell）,是体内NKT细胞的一类亚群，具有CD1d限制性。
胸腺中的CD4+CD8+双阳性的前体细胞发育为成熟的iNKT细胞后进入外周淋巴组织，主要通过分泌不同的细胞因子调节机体Th1/Th2类免疫应答的平衡，也可以通过与树突状细胞的相互作用增强NK细胞和细胞毒性T细胞的作用，以杀伤肿瘤。
γδT细胞起源于骨髓来源的CD4-CD8-双阴性前体细胞，在胸腺中经历阴性选择故获得自身免疫耐受性，不经历阳性选择故获得非MHC限制性，识别抗原谱广，类似于NK细胞，γδT细胞不仅可以直接通过穿孔素/颗粒酶途径直接杀伤靶细胞，还可以通过Fas-FasL 途径诱导靶细胞凋亡，并且可以分泌细胞因子和趋化因子，调节体液免疫和细胞免疫。
γδT细胞甚至可以作为专职的抗原提呈细胞发挥抗原呈递作用。
以上3种细胞均为人体免疫系统的重要组分，在机体抗感染、抗肿瘤等免疫反应中拥有巨大潜能，近年来相关研究热度较高，主要集中在如何提高细胞扩增效率，以及扩增后的效应细胞是否能够保持甚至提高杀伤肿瘤和抗感染的能力。
本课题中，我们采集健康供者的静脉血，分离得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），在体外活化并大量扩增NK细胞、iNKT细胞和γδT细胞，通过对比扩增培养前后的细胞数量，及扩增培养后得到的免疫细胞的表面分子表达情况、细胞因子分泌情况、对肿瘤细胞的杀伤活性，进一步探索以上细胞体外扩增的效率及以上细胞应用于肿瘤治疗的可行性，这将为恶性肿瘤的过继性细胞免疫治疗的临床应用提供有力的实验室依据。
体外t细胞耗竭模型原理
体外t细胞耗竭模型原理体外T细胞耗竭模型是一种研究T细胞生物学功能和免疫应答机制的实验模型。
该模型通过体外培养方式使T细胞持续刺激暴露于活化状态，从而诱导T细胞衰竭。
体外T细胞耗竭模型的研究对深入了解T细胞功能调控机制和应对肿瘤、感染等疾病具有重要意义。
体外T细胞耗竭模型的实验过程通常包括以下几个步骤：初始T 细胞活化、连续刺激、功能特征鉴定、细胞检测和实验结果分析。
首先，为了使T细胞进入活化状态，研究人员通常通过使用抗CD3和抗CD28等细胞表面激活抗体，对T细胞进行刺激，模拟体内免疫应答。
这种刺激可以激活T细胞表面的共刺激分子和信号传导通路，使T 细胞开始增殖和产生细胞因子。
接下来，为了模拟T细胞长期持续刺激的环境，研究人员将活化的T细胞连续培养在含有靶细胞、肿瘤抗原、细胞因子等刺激物质的培养基中。
这种刺激环境可以使T细胞得到持续的活化信号，从而诱导T细胞功能紊乱和耗竭。
在连续刺激阶段，研究人员通常会观察T细胞的功能特征和表型变化。
例如，通过检测细胞因子产生水平，如干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）等，可以评估活化的T细胞的生物学功能。
同时，通过流式细胞术检测细胞表面标记物的表达，如程序性死亡受体1（PD-1）、淋巴细胞功能相关抗原4（CTLA-4）等，可以评估T细胞的抑制性和活化状态。
在连续刺激和功能特征鉴定阶段，研究人员还可以根据需要使用特定的靶细胞、肿瘤抗原和共刺激分子来模拟不同疾病状态下的免疫应答。
例如，在研究肿瘤免疫治疗时，可以使用肿瘤细胞或表达肿瘤抗原的靶细胞来模拟肿瘤免疫应答。
在细胞检测阶段，研究人员通常通过流式细胞仪等技术对T细胞进行检测和分析。
流式细胞仪可以对细胞进行单个细胞水平的多参数检测，包括表面标记物表达、胞内细胞因子水平等。
通过这些检测，可以评估T细胞的功能状态、抑制性效应和活化程度。
最后，通过对实验结果的分析和统计，研究人员可以得到有关T 细胞功能调控机制和耗竭过程的重要信息。
T细胞培养
293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
原代t细胞培养方法
原代t细胞培养方法
原代T细胞一般在体外的培养时间不超过三周，用于功能实验的T细胞建议培养时间在14天以内。
以下是一个原代T细胞培养方法：1. 将含有1%青霉素-链霉素及5%血清的X-VIVO15培养基恢复至室温，重悬分离后的T细胞，加入anti-human CD3/CD28磁珠（与细胞数量1∶1），促进T细胞活化和增殖。
2. 加入300 U/mL IL-2使其分化和增殖为效应T细胞；或5 ng/mL IL-15促使T细胞分化和增殖为记忆T细胞。
不同免疫细胞涉及的细胞因子、激活信号大不相同，因此培养体系也不可同一而论，同一免疫细胞不同来源（如PBMC来源、脐带血来源、iPSCs或ESCs）的具体培养方案也存在差别。
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目前应用于临床的治疗的T细胞有如下几种：
1、CD3AK细胞
CD3AK细胞全称为抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞，当淋巴细胞与抗CD3单克隆抗体共育2-3天，淋巴细胞可以明显增殖，此种激活为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需抗CD3单克隆抗体持续存在而发挥作用。
只会在加入低剂量的IL-2继续培养即可维持起活跃增殖，经2-3周培养后可获得大量的表现为CD3+、CD4以及CD8+的混合体，且随时间延长，CD3+和CD8+双阳性细胞的比例增加，而CD4+和CD8+双阳性的比例则下降。
因此，CD3AK细胞在表型上似乎接近于CTL。
具体培养方法:
1、培养前1天以含CD3Ab 5 mg／L的磷酸盐缓冲液
(PBS)20 ml平铺培养瓶，4℃过夜包被；
2、培养第1天弃去PBS，以PBS冲洗2 次及1640培养液
冲洗1次，加入1 000 U／ml的 IFN-γ，置于37℃体积分数为5％C02的饱和湿度培养箱中；
3、24小时后加入1 000 U／ml的lL-2。
4、继续培养
2、CIK细胞
CIK细胞的全称为细胞因子活化的杀伤细胞，它是在多种细胞因子（IFN-γ，CD3单抗，CD28单抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血单核细胞可以被定向诱导并大量增殖成为具有抗肿瘤活性的细胞群。
CIK细胞的表型主要为CD3+CD56+,是来源于PBMC中的T细胞（CD3+CD56-）。
具体培养方法：
3、LAK细胞
LAK细胞全称为淋巴因子激活的杀伤细胞，可在外周血单核细（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，称为LAK细胞。
LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。
4、TIL细胞
TIL细胞的全称为肿瘤浸润淋巴细胞。
它的制备方法与LAK细胞相似，所不同的是TIL的细胞来源是肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞，用少量的IL-2细胞刺激后，能大量扩增表型为CD4+及CD8+为主的T细胞。
外周血单核细胞（PBMC）分离实验
血标本：EDTA（2%）盐抗凝血：采集后可4度保存不超过半天，尽量早处理。
10ml抗凝血分2份（分离淋巴细胞可稍多）。
外周血单核细胞（PBMC）分离步骤：
1.吸出10ml新鲜抗凝血（含2%EDTA）至50ml离心管中，加入
10mlPBS混匀，此时共20ml；
2.2个50ml离心管内分别加入10ml外周血单核细胞（PBMC）分离
分层液；
3.向装有分层液的50ml的离心管分别加入10ml稀释样品，注意缓
慢加入，不要冲破液面，2000r/min离心20分钟；
4.巴氏管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一个离心管
中，避免吸入分层液和血浆（2管混入一个离心管）；
5.加入5ml PBS，1800r/min离心5分钟；
6.弃上清，取沉淀，再次加入5mlPBS混匀成细胞悬液，
1000r/min离心5分钟，弃去上清，保留沉淀;
7.2ml 1640 培养基重悬后移至培养瓶中培养
需要购买的试剂：外周血淋巴细胞分离液、anti-CD3抗体、IL-2、IL-1、IFN-γ。