2.1 体外培养细胞的分类
体外培养细胞的基本形态
体外培养细胞的基本形态
体外培养细胞的基本形态通常可以分为以下几种：
1. 悬浮细胞：这种细胞没有任何附着物质，完全悬浮在培养基中。
悬浮细胞的形态通常呈现为圆形、椭圆形或不规则形状。
2. 基质附着细胞：这种细胞会附着在培养基的底部或其他附着物质上。
它们通常呈现为扁平的形状，并且会伸出像触角一样的细胞突起。
3. 单层附着细胞：这种细胞生长在平坦的基质上，形成一个单细胞层。
其形态通常呈现为扁平的形状，并且细胞之间呈现较为规则的排列。
4. 多层附着细胞：这种细胞会从单层细胞增殖而来，形成多层细胞堆叠的结构。
上层细胞通常会呈现较为扁平的形状，下层细胞则呈现更加立体的形态。
除了这些基本形态，不同类型的细胞在体外培养时还可展现出不同的特征形态。
需要注意的是，体外培养条件可能会对细胞形态产生影响，所以在实验过程中需要综合考虑培养条件对细胞形态的影响。
细胞名词解释
细胞名词解释1.愈伤组织：原意是指植物体的局部受创伤刺激后，在其伤⼝表⾯新⽣的⼀团薄壁细胞。
在组织培养中是指在⼈⼯培养基上由已经分化的外植体的细胞重新分裂⽣长⽽形成的⼀团⽆特定形状、⽆序⽣长的薄壁细胞。
在⼀定条件下离体状态的植物组织中已经分化并停⽌⽣长的细胞重新分裂⽣长所形成的⽆组织结构的细胞团。
2.外植体：指植物组织培养中作为培养材料的离体组织块离体器官或离体细胞。
3.胚状体：由外植体或愈伤组织产⽣的与正常受精卵发育成的胚相类似的胚胎状结构。
据来源分为体细胞胚与⽣殖细胞胚。
4.极性：⾼等植物均具⼀主轴，各器官沿此主轴有顺序的进⾏⽣长分化。
主轴的⾸尾两端在⽣理形态上都有着明显差异，通常⾸段⽣芽尾端长根（形态学上端下端）这种现象叫极性。
5.植株再⽣：指通过组织培养技术将植物的细胞、组织、器官等培养成完整植株的过程。
6.形态发⽣（形态建成）：指⽣物个体发育或再⽣过程中⽣物体及其器官的形态结构的形成过程。
7.试管苗：指在⽆菌离体条件下的⼈⼯培养基上对植物细胞、组织或器官进⾏培养所获得的再⽣植株。
8.玻璃苗：指外表呈玻璃状，幼茎、叶⽚呈现半透明⽔渍状态的畸形试管植物。
9.体细胞⽆性系：指由同⼀个外植体反复进⾏继代培养后得到的⼀系列后代。
在细胞培养中，由单细胞形成的后代叫但细胞⽆性系。
10.培养基：⽤于满⾜植物正常发育所需各种营养物质的总和。
11.初代培养：指从植物体上分离外植体进⾏的第⼀次培养。
12.继代培养：将初代培养的培养物（愈伤组织、芽等）重新切割转移到新的培养基上继续扩⼤培养的过程。
13.固体培养：指加⼊琼脂等固化剂使培养基呈固体状态所进⾏的培养。
14.液体培养：指不加Agar等固化剂使培养基呈液体状态所进⾏的培养。
U11、细胞⼯程：按照⼀定的设计⽅案，通过在细胞、亚细胞或组织⽔平上进⾏实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性⽣物⼯程。
2、摇床：常⽤来进⾏细胞悬浮培养，可根据震荡⽅式分为⽔平往复式和回旋式两种，震荡速度因培养材料和培养⽬的的不同⽽不同，常⽤的震荡速度为100r/min.3、培养瓶：⼀般的植物组织和细胞培养常⽤玻璃三⾓瓶、试管、各种⼤⼩的⼴⼝玻璃瓶时，有时甚⾄⽜奶瓶和罐头瓶也都可以利⽤，特别是在进⾏快速繁殖时更常⽤造价较低的培养器⽫。
干细胞的体外培养概述
干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂
干细胞的对称分裂和不对称分裂
4、胚胎干细胞的分离和培养
（1）培养液
配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素 污染，水要现用现制。
高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为 （4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎 干细胞集落形成。
使用前还要添加β-巯基乙醇（0.1mmol/L）或单硫甘 油（ 0.15mmol/L）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯 基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。 使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。
干细胞几个主要特征
干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说 干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微 环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细 胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。
在不同生长因子刺 激下干细胞可表现 出不同分化潜能
干细胞几个主要特征
干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持 为干细胞或分化为特定细胞。
30
其它干细胞的分离与纯化
干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统 为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。 另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物， 如人造血干细胞表现为CD34+和Thy10+而CD10， CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理 特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和 Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标 志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即 可分离纯化干细胞。
体外培养——精选推荐
体外培养：将活体细胞成分（活体组织、活体器官、活体细胞）甚至活的个体（病原微生物）从体内或寄生体内取出放在类似于体内生存环境的体外环境，让其生长发育的过程。
2、器官培养：将活体器官或器官原基放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。
3.器官的体外培养：值整个器官、器官的一部分或器官原基放在体外环境中，让其生存和生长的过程。
4、组织培养：将活体组织放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。
5、细胞培养：将活体细胞（分散的细胞）放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。
6.体内培养：将活体结构成分，从生物体内或寄生虫体内取出放在另一种生物体内然后进行生长发育的过程。
7.细胞系：原代培养植物经首次培养后获得的种群。
8、细胞株：通过选择法或克隆法，从原代细胞器中或培养物中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。
9、原代培养：指第一次培养将培养物放置在体外培养环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
10、传代培养：指培养物长满培养空间，并发生相互接触性抑制现象，需要将培养物分割成小部分，重新将培养物放入另外的培养器皿内进行培养的过程。
11、生长基质：泛指培养物附着的各种介质。
狭义特指在塑料或玻璃表面涂布一层能够促进培养物吸附，帖壁与铺层的生物活性物质。
12、复苏：以一定的复温速率将冻存培养物恢复到常温的过程。
13、动物细胞大规模培养技术：人工条件下（设定PH值，温度溶氧，培养工艺等）在动物细胞生物反应器中高密度大量的培养有用动物细胞，以生产珍贵生物制品的技术。
14、悬浮培养：质细胞在生物反应器中自由悬浮培养的过程。
15、固定化培养：将动物细胞与水不溶性载体结合起来在进行培养的过程。
16、结缔组织：是动物体内主要的支持性组织，由结缔组织和大量间质构成。
17、寄生虫的体外培养：模拟宿主体内环境，对寄生虫某一生活史阶段的虫体或细胞进行离体培养过程。
间充质细胞：各种结缔组织细胞的干细胞。
体外培养物的生物学特性
❖必须贴附于底物才能生长的细胞称为贴附 依赖性细胞。
❖目前已有很多种细胞能在体外培养生长， 包括正常细胞和肿瘤细胞。例如：成纤维 细胞、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、皮肤 及各种肿瘤细胞等。
这些细胞在活体内时，各自具有其特殊 的形态；但是处于体外培养状态下的贴 附生长型细胞则常在形态上表现为比较 单一化而失去其在体内原有的某些特征， 并多反映出其胚层起源的情况.
第三章 体外培养物的生物学特性
第一节 体外培养物的生长方式及类型
❖ 一、培养细胞的生长类型 1、悬浮生长型细胞：如淋巴细胞、白 血病细胞（HL-60）、CHO细胞等。 少数细胞类型在体外培养时不需要附着 于底物而于悬浮状态下可生长，包括一 些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其 是血液白细胞，以及癌肿细胞。 这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单
已加倍。 ❖ 在G2期主要的变化是DNA修复、染色质螺旋
化凝集。 ❖ 对外界环境敏感，易受温度、pH及各种其它
因素的影响受阻不能进入M期，但相关因素消 除后能很快恢复。
❖ [M期] : 30-60分钟
❖ 细胞分裂过程分前、中、后、末四期。
1）前期：20分钟
❖ G2期结束后的细胞如何过渡到前期的，尚难 确定明显的标志，
无增殖力细胞
G0期
暂不增殖细胞
死亡
❖间期：G1期十S期十G2期 ❖细胞周期：G1期十S期十G2期十M期
（一)细胞周期各时相的特性
❖ [Gl期]：
❖ 短则4-5小时，长则时间不定，Gl期时 间长短是细胞周期时间差异的主要因素。
❖ 在Gl期主要发生DNA合成前的生化变化， 如DNA聚合酶和RNA的合成等。
细胞培养复习题(含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型:粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面, 而在悬浮状态下即可生长的细胞。
（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。
）⑵可分四型: (1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常, 体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段:①原代培养期: 也称初代培养, 是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。
此期的细胞呈现出活跃移动的特点, 可见细胞分裂, 但不旺盛。
处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。
细胞群具有明显的异质性, 细胞间的相互依存性强, 在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②. 传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期, 原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。
一般情况下, 正常体细胞在传代10-50次左右后, 细胞分裂的能力就会逐渐减弱, 甚至完全丧失, 细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞, 增殖速率已经变得很慢或不再增殖, 直至最后衰退死亡。
以上特点, 主要是针对体外培养的机体正常细胞, 对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言, 永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力, 这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态, 也称悬浮期。
此时细胞质回缩, 胞体呈圆球形。
时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上, 游离期结束。
底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动, 而无细胞分裂。
细胞株潜伏期一般为6～24小时。
④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长, 活力最佳, 最适合进行实验研究。
细胞培养1
1、细胞生长方式及类型体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴附型、悬浮型及半贴壁细胞。
（1）贴附生长型细胞：为附着于底物（支持物）表面生长的细胞。
①上皮细胞型：扁平的多角形，生长特点为细胞之间紧密相靠、相互衔接，呈铺路石状，具有连接成片的能力。
②成纤维细胞型：梭形，不规则三角形或扇形，生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片，而是排列为旋涡状、放射状，或似栅栏状。
③游走型细胞：外形不规则且不断变化，生长特点为一般不形成群落，经常处于较活跃的变形及游走状态。
④多形型细胞：形态不规则。
（2）悬浮生长型细胞：在体外培养是不需要附着于底物，在悬浮状态下即可生长。
特点为生存空间大，只需稀释而不需消化处理，具有能够提供繁殖大量细胞、传代繁殖方便、易于收获细胞等优点，但是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养的细胞都能悬浮生长。
（3）半贴壁细胞：即可贴壁生长，也可以是悬浮培养，条件改变，细胞形态可有变化。
2.体外培养细胞的生存和增殖特点（1）贴附和伸展：使多数体外培养细胞的基本特点。
培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球状体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈纤维细胞样或上皮细胞样等。
其影响因素有①促细胞附着物质：如基膜素、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、血清扩展因子②离子作用：如细胞的伸展需要有钙离子的存在，含低浓度钙的培养液不利于细胞的生长③物理以及机械因素：如底物的表面结构、温度、培养液流动过快等④生物因素（2）运动的接触抑制：正常的细胞存在不停顿的活动和移动，其外周的细胞膜呈现一些特征褶皱样活动。
但当俩个细胞移动而相互靠近时，其中之一或俩个将停止移动并向另一个方向离开，这保证了细胞将不会重叠，当一个细胞被其他细胞围绕至无处可去而保持接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜褶皱样活动将停止，此即接触抑制（3）增殖的密度抑制：当细胞增殖、汇合形成单层时。
细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，细胞分裂终止。
动物细胞体外培养知识
5
三、基本过程
1、从整个操作过程来说包括： （1）细胞小瓶培养---传代操作 （2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作 （3）细胞冻存和复苏---原则 2、从细胞生长过程来说包括： （1）延迟期（潜伏期）---传代初期，细胞增殖缓慢。 （2）指数生长期（对数生长期）---细胞快速繁殖期。 （3）停滞期（平台期）---细胞数量不变， 但仍进行代谢活动，进行分泌表达。 （4）衰亡期（凋亡期）---细胞自溶、死亡。
动物细胞体外培养基础知识
2009-09-25 石欣欣
1
基础知识要点
一、动物细胞培养的基本概念 二、细胞培养的基本条件 三、细胞培养的基本过程 四、细胞培养的设施设备及培养器皿 五、细胞传代的准备工作 六、细胞培养的基本操作 七、细胞库 八、大规模细胞培养提高表达量需要解决的问题 及实验方法 九、细胞培养需要注意的问题
12
5、大规模细胞培养方式简介：
（1）分批式培养：该方式采用机械搅拌式生物反 应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应 器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添 加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当 的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作 方式。
13
（2）流加式培养：是在批式培养的基础上，采用 机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以 悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养 基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中 根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓 缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较 高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养 过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或 衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞 和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。
14
（3）半连续式培养：又称为重复分批式培养或换 液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮 培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间 隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培 养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞工程体外培养细胞的分类
体外培养细胞的分类
按生长方式
贴壁型细胞（Monolayer cells）
悬浮型细胞（Suspension cells）
绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。
按细胞形态(贴壁细胞）
成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells）
上皮型细胞（Epithelium-liked cells）
其它，不定型
体外细
胞生长
贴壁型
悬浮型
多形型细胞（神经元和神经胶质细胞
，呈多角形）
上皮细胞型（上皮、肝、胰和肺泡上
皮等，源于外胚层和内胚层细胞）
成纤维细胞型（心肌、平滑肌、血
管内皮等，源于中胚层细胞）
游走细胞型（单核细胞、巨噬细胞
和某些肿瘤细胞，形状不定）
生长时不贴壁，如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤细胞
贴壁型生长细胞
处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。
形态各异反映其胚层起源。
如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。
成纤维型细胞
胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞
质向外伸出2-3 个长短不同
的突起，细胞呈放射状、火
焰状或漩涡状生长。
上皮型细胞
胞体呈扁平不规则多角形，中有圆形
核，细胞紧密相连成
单层膜。
游走型细胞
在支持物上散在生长，胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，运动速度快而不规则，细胞形态不稳定，有时难以与其他型细胞相区别。
多形型细胞
由于难以确定其形态而得名。
悬浮型生长细胞由于悬浮在培养液中生长，
生存空间大，可维持对数生长期，也允许长时间生长，传代繁殖方便，能繁殖更多细胞，饱和度大，可达高密度，适合大量生产，有
工业应用价值。
传代时只需稀释，无需消化
处理，易于收获，便于做细胞代
谢等研究。
习题
1.体外培养细胞分那几类？
2.贴壁型细胞生长有什么特点？
3.悬浮型细胞生长有什么特点？。