体外培养细胞转化
格里菲斯体外转化实验过程
格里菲斯体外转化实验是一种常用的分子生物学技术，用于将外源DNA导入到细菌细胞中。
这种方法是由赫伯特·W·格里菲斯于1928年首次描述的，后来被称为“格里菲斯实验”。
以下是格里菲斯体外转化实验的基本步骤：1.准备接受细胞：首先，需要选择合适的宿主细胞，通常使用大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌。
这些细菌通常是在培养基中生长并具有较高的转化效率。
2.制备DNA样品：接下来，需要准备含有外源DNA的样品。
这些DNA样品可以是纯化的质粒DNA、线性化的DNA片段或基因组DNA。
DNA样品通常在实验室中通过DNA提取、PCR扩增等方法获得。
3.制备质粒DNA：如果使用质粒DNA作为外源DNA，需要将质粒DNA经过适当的处理（如线性化）以提高转化效率。
4.转化实验：将目标细菌细胞与外源DNA混合，并将其暴露于特定的条件下，使DNA能够进入细胞内。
通常，这个过程需要通过热激冲（heat shock）、电穿孔（electroporation）或化学法（如钙离子诱导法）等方法来实现。
5.恢复生长：转化后的细菌需要在适当的培养条件下进行恢复生长，以使转化的DNA在细菌中复制和表达。
这通常涉及将细菌转移到富含培养基的琼脂平板上进行培养。
6.筛选与鉴定：为了确定转化是否成功，通常会使用选择性培养基或基因标记来筛选转化细胞。
成功的转化通常会导致表达外源基因或表型改变，可以通过PCR检测、酶切分析、蓝白斑筛选等方法来鉴定。
总的来说，格里菲斯体外转化实验是一种常用的方法，用于将外源DNA导入到细菌细胞中，并使其在细菌中复制和表达。
通过这种方法，研究人员可以研究基因功能、基因调控、蛋白表达等多个方面的生物学问题。
低密度脂蛋白对体外培养的肾小球系膜细胞表型转化的影响
姜晓刚 王 旭 粘洪晓 张丽。 孔灵玲 李永华 崔 文 朱任之
（ 理学教研室 莱 阳市第二人 民医院 中医学教研 室 营养学教研室 兰州大学 ） 病
提 要 目的 通过低 密度脂蛋白（ Ｌ 的刺激 ， ｕ） ） 观察 Ｌ Ｌ对体外培养的大鼠肾小球 系膜细胞表型转 Ｄ 化的诱导作用。方法 采用不同浓度 的 Ｌ Ｌ ０ ２ ，０ １０ １０ ｇｍ１ Ｄ （ ，５ ５ ，０ ，５ｔ ／ ） ￣ 刺激体外培养的大鼠肾小球 系膜细 胞的水平， 以台盼蓝染 色检测 Ｌ Ｌ对 系膜细胞的毒性作 用， Ｔ 比色法检测细胞增殖 ， Ｄ ＭＴ 透射 电镜观察系膜 细胞 的形态学变化 ， 免疫细胞化学染色及 Ｗｅ ｅ ｌ 检测 ａ Ｓ ｓｒ ｂ ｔ ｔｎ ｏ — ＭＡ、 Ｔ Ｆ Ｉ型胶 原及 Ｆ Ｃ Ｇ 、Ｖ Ｎ的表达。结果 在 Ｌ Ｌ作 用 下 ， 置显微镜 下 细胞 变为 长梭 形 ， Ｄ 倒 透射 电镜 下细 胞表 面微 绒 毛减 少。免 疫 细胞 化 学 染 色及 Ｗｅｔｒ ｌ 显 示 ａ ｓ ｎｂ ｔ ｅ ｏ 一 、 Ｔ 、Ｖ Ｃ ＧＦ Ｉ型胶 原及 Ｆ Ｎ表 达增 强 。结 论 在 Ｌ Ｌ刺激 下 ， Ｄ 系膜 细胞 可 以发 生表
型 转化 。
关键词 低 密度 脂蛋 白； 系膜 细胞 ； 型转化 ； 表 纤维化 肾小球硬化是多种 肾脏疾病 终末期 的最终 归 孔底时换无血清 Ｒ ＭＩ ６０ Ｐ ４ 培养液培养 ２ ｈ使 多 １ ４，
数细胞 同步于静止期后分为下列各组 ：１正常对照 （） 组（ Ａ组 ） （ ） ５ｇ ｍｌ Ｄ ，２ ２ ｔ ／ Ｌ组 （ ￣ Ｌ Ｂ组 ） （ ）０￣／ ，３ ５ ｔ ｍｌ ｇ Ｌ Ｌ组 （ Ｄ Ｃ组 ） （ ）０ ｔ ／ Ｄ 组 （ 组 ） （ ） ， ４ １０￣ ｍｌＬ Ｌ ｇ Ｄ ， ５ １０ ｇｍｌ Ｅ组）于培养后 ２ ｈ３ ｈ和 ４ ｈ收集 ５ｔ ／ 组（ ￣ ， ４ ，６ ８ 与 肾脏 纤维化 的关 系成 为 肾脏 病 学 研 究 中的热 点 ， 细 胞 ， 台盼蓝染 色 ， 进行 活细胞 计数 。 但多集中于肾小管上皮细胞与 肾间质的关 系上 ２， ２ Ｊ 细胞增殖水平测定 ： 实验步骤同上 ， 细胞同步后 而对其能否促进体外培养 的 ＭＣ 发 生表型转化则 分为 ５ ， Ｓ 组 并设阴性对照组 （ 不加刺激因素， 加入等 缺 乏研 究 。本 实 验 拟用 低 密 度 脂 蛋 白 （ｏ ｅｓ ｙ １ｗ ｄｎｉ 量 培养 液 ） 空 白对 照 组 （ 加 细胞 ， 入 等 量培 养 ｔ 及 不 加 ｌ ｏｒｔｎ ｕ）） ｉ ｐｏ ｉ， Ｌ 作用于体外培养的 ＭＣ ， ｐ ｅ ｓ于细胞水 液）接种于 ９ 孔培养板 ， ， ６ 于孵箱中培养 ２ ｈ４ ｈ和 ４ 、８ 平观察其能否诱导 ＭＣ 发生表型转化及其对细胞 ７ ｈ ， Ｓ ２ 后 加入 ＭＴ １ｔ／Ｌ ３℃继续培 养 ４ ， Ｔ ０ 孑 ，７ Ａ ｈ 终止 生长和功能的影响。 培养 ， 吸弃孔 内上清 液， 加入 Ｄ Ｏ ０ ／Ｌ 振 荡 ＭＳ ９ ｔ 孑 ， Ａ １ 材料和方法 １ ｍ ｎ充分溶解结晶物， ０ ｉ， 于酶联免疫检测仪上选择 １１ 实验材 料 ． ４０ ｍ 波 长 ， 定各 孔 吸光度 Ａ值 。 ９ｒ ｉ 测 胎牛血清（ 杭州 四季青生物公司）胰蛋 白酶（ ， 西 细胞形态学观察 ： 倒置相差显微镜观察细胞表 安华美生物公司） 小 鼠抗大 鼠 ａ ＭＡ单克隆抗 型转化过程中的形 态变化 ， ， —Ｓ 透射 电镜观察其超微结 体， 兔抗 大 鼠 Ｃ Ｇ 、 Ｎ、Ｖ Ｔ Ｆ Ｆ Ｉ 型胶 原 单 克 隆抗 体 ， 构改变。 ＳＢ Ａ Ｃ试剂盒及 Ｗｅ ｅ ｌ ｔ ｇ ｓ ｒ ｂ ｔｎ 检测试剂盒 （ ｔｎ ｏ ｉ 武汉 免疫细胞化学染色 ： 将盖玻片预先置于 ６ 孔培 博士德生物公 司） Ｌ Ｌ 中国医学科学 院基础 医学 养板 内， ，Ｄ （ 然后将 ＭＣ 以 ５ ０ 个／ ｌ Ｓ ×１ ｍ 接种于 ６ 孔板 研究所生化室）Ｒ ＭＩ ６０ Ｇ Ｂ Ｏ公 司） ，Ｐ ４ （ ＩＣ １ 。 内， 以含 １ ％Ｆ Ｓ的 Ｒ ＭＩ ６ ０ ０ Ｃ Ｐ ４ 培养 液培养 ２ｈ １ ４， １２ 实验方法： ． 换无血清培养液使 多数细胞同步后 ， 将其进行同上 细胞培养 ： 大鼠肾小球 ＭＣ 引 自中山大学医学 分组 ， Ｓ 培养 ７ 后 ， Ｓ Ｂ ｄ 行 Ａ Ｃ法免疫 细胞化学染色 。 院， 经鉴定后用于本实验。实验中肾小球 ＭＣ 细胞 以已知 阳性结果为阳性对照 ， Ｐ Ｓ代替一抗为阴 Ｓ 以 Ｂ 株 以含 １ ％胎牛血清 （０ Ｃ ） Ｒ ＭＩ ６ ０ ０ １ ％Ｆ Ｓ 的 Ｐ ４ 培 性对照 。结果 以胞 浆 内出现棕 黄色颗粒为 阳性信 １ 养液 ， ３ ℃ ，％Ｃ ２ 和孵箱 内培养 。每 ２ ｄ 号 ， 置 ７ ５ Ｏ饱 ～３ 阴性 为无 着色。高倍镜下 （ ０ ×４ ０倍） 观察 ２０ ０ 换 液 和传 代 。 当细 胞 长 至 贴壁 ８ ％ ～９ ％且 台 盼 个 细胞 ， 出 ａ ＭＡ染 色 阳性 的细胞 数 。 ０ ０ 数 —Ｓ 蓝 染色 活细胞 达 ９ ％以上 时 ， 含 １ ％Ｆ Ｓ的 Ｒ ． ５ 将 ０ Ｃ Ｐ Ｗｅｔｒ ｌｔ 定 ａ一 ｓｅｎｂ 测 ｏ 、Ｔ Ｃ ＧＦ蛋 白表 达 ： ＭＩ ６０ ４ 培养液完全吸出 ， １ 换成 由不含胎牛血清 的 收集经不 同浓度 Ｌ Ｌ刺激的生长状态 良好 的培养 Ｄ Ｒ ＭＩ ６ ０ Ｐ ４ 培养液配制的不 同浓度 的 Ｌ Ｌ ０ ２ ， ７ 的 ＭＣ ， １ Ｄ （ ，５ ｄ Ｓ加细胞裂解液后离心， 取上清 ， 测定蛋白 ５ ，０ ，５ｔ ／ ）继 续在孵箱 内培养 ， ０ １０ １０ ｇｍ１， ￣ 中间换 液 浓度。加上样液于 １ ％Ｓ Ｓ 聚丙烯酰胺凝胶进行 ０ Ｄ 一 及传代时继续用上述因素刺激。 电泳分离 ， 电转移 至硝酸纤维素膜上 ， ％脱脂奶粉 ５ 细胞毒性实验 ： 取消化后的 ＭＣ 以每孔 ５ ０ Ｓ ×１ 封闭， 加小 鼠／ 兔抗大 鼠 ａ ＭＡ或 Ｃ Ｇ —Ｓ Ｔ Ｆ一抗孵 个／ ｌ ｍ 接种于 １ 孔培养板 ，４ 后 细胞接近于铺满 育 ， ２ ２ｈ ４ ℃过夜 ， 加辣根 过氧化物酶标记 的抗小 鼠／ 兔
一、肿瘤细胞体外培养的重要性
5．培养基
在癌细胞建系中，选择性培养基的应用 是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细 胞生长的关键技术改进。选择培养基是 针对特殊细胞生长的营养要求设计的。 针对癌细胞的特点，选择性培养基应含 少量血清。
血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因 此用低或无血清培养基为好。改良RPMI-1640培养基可 提高癌细胞存活。
在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中 EGFR的含量极高，Artrazeneca公司的研究人员 于1998年率先提出通过开发阻断EGFR的药物，
可以抑制肿瘤的生长，这种全新的疗法就是现在
的靶向性疗法，它没有毒副作用，不会杀死正常
细胞，按照这种思路，基因技术公司开发出一种 治疗晚期乳腺癌的药物Herceptin，并于1998年 获准上市。Herceptin是一种单克隆抗体药物，靶 向HER-2，这种药物能使只有5个月寿命的晚期 乳腺癌病人继续生存。为什么Herceptin成功获准，
由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行 试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅） 的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。
Astrazeneca公司的肺癌药Iressa等都是靶 向 药 物 ， 靶 EGFR， 但 成 功 的 只 有 Herceptin。Iressa 只 在 1 0 ℅ 肺 癌 患 者 中 有 神奇作用，但在大规模的临床试验中90℅ 人无效。花3亿美元，10年时间，未获批准。
肿瘤发生发展结局的机理研究进入分子水平，人类 最终认识肿瘤才可以征服肿瘤。若癌变 的始发变化
是基因活动的调控失常，癌变就具有潜在的可逆行， 就可以为肿瘤治疗开辟一个完全新的途径—控制调 控机制；若癌变的本质是基因突变，那就意味着癌 变不可逆，只有了解其突变的部位，只有通过基因 治疗，而所有这种机理的研究，其中一个重要的手 段是通过肿瘤细胞的体外培养进行研究。虽然体外 培养不能完全反映体内情况，但为单因素、多因素 研究提供模型。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
培养细胞的细胞生物学(体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生
培养细胞的细胞生物学（体内外细胞差异与体外培养细胞的分型、生一、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。
且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。
细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。
恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。
2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如 Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
二、体外培养细胞的分型（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。
另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
t淋巴细胞转化实验报告
t淋巴细胞转化实验报告淋巴细胞转化实验是一种体外培养方法，用于研究免疫细胞对不同物质的反应，包括抗原、细菌、病毒等。
本实验采用人体外周血淋巴细胞作为材料，通过添加激动剂使其转化为体外培养的淋巴母细胞，然后进行免疫学研究。
本报告将对本实验的过程和结果进行描述和分析。
实验步骤1.收集外周血从正常成年人的静脉血收集外周血，将其分装到离心管中。
用 PBS 冲洗红细胞，使淋巴细胞纯化后采集上清液。
2.细胞数计数采用血细胞盘进行计数，每个实验需要约 4-6万个淋巴细胞，取相应数量的细胞用1640 培养基含有 10% 胎牛血清的细胞密度中稀释。
3.淋巴细胞培养将稀释的淋巴细胞在细胞密度2 × 10^5/ml 的情况下播种在 96 或 48 孔板的深孔中，然后加入不同的激动剂，如激活剂、抑制剂、细胞因子等，同时添加乙酰溴芬酸作为负对照组。
4.腺病毒载体转染在淋巴细胞培养的第 2，3 天，加入适量的腺病毒载体（MOI 为 50），接种24 h 后用媒介液冲洗并更换新的培养液，然后让细胞继续培养。
5.淋巴细胞功能检测对于 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞，通过检测它们的增殖和检测分泌的细胞因子的表达来评估激动剂的效应。
在体外转化过程中，通过荧光PCR技术检测核因子-κB 和JAK/STAT 信号通路的激活。
实验结果本实验采用血细胞盘计数，每个实验需要约 4-6 万个淋巴细胞。
将这些细胞培养在96 或 48 孔板的深孔中，添加不同的激动剂，保持在合适的细胞密度。
添加适当的激动剂，可以在淋巴细胞转化的过程中发现一系列的细胞反应，如细胞增殖，细胞因子的分泌等。
实验分析本实验是一项重要的免疫学研究方法，可以用于检测免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞）对外来物质的反应。
适当地添加激动剂，可以诱导免疫细胞在体外转化成淋巴母细胞，从而在体外模拟免疫反应过程。
在本实验中，采用了血细胞盘计数，这是一种传统的细胞计数方式。
肿瘤细胞体外培养的重要性
癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因
素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、 基因调节包括细胞周期基因和癌基因、cAMP 和cGMP浓度（前者对细胞增殖负调节，而后 者为相反）。
正常细胞周期的G1期有一个特殊的调节点—R点， 在生长条件不适宜情况下，细胞不能通过调节点而 不增殖，细胞通过G1期进入M期前受一种不稳定蛋 白质调节通过R点启动DNA的合成，例如抑癌基因 P53最重要的生物学功能就是通过调控细胞周期监测 点来维持基因组的稳定性，当细胞DNA受损时，P53 诱导细胞周期终止或凋亡，而P53突变或缺失使P53 功能失活则导致基因组紊乱，产生细胞转化。
由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行 试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅） 的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。
肿瘤对化疗和放疗抗性的一种机制是由 于P53突变或P53的缺失，人类癌50 % P53 突变
Non small cell lung
60 %
Colon
50 %
Breast
40 %
Head and neck
60 %
Ovarian
60 %
②制备单克隆抗体，主要是靶向表皮生长因子 EGF受体EGFR和HER-2。80年代研究人员发现，
当前较有前景的靶向治疗
①现在发展的基因工程腺病毒（ONYX015）因删除了E1B 55KD蛋白而可以选 择性的溶解P53突变或缺失的肿瘤细胞， 此类肿瘤细胞占50℅，也就是腺病毒 ONYX-015可达到50℅的靶向治疗药物的 效果，目前已在头颈部肿瘤中进行Ⅱ期 临床试验。
当前较有前景的靶向治疗
一、肿瘤细胞体外培养的重要性
恶性肿瘤细胞培养建立细胞系，包括癌细胞 系和转化细胞系。转化细胞系可以是恶性转 化细胞和一般转化细胞两种。
鸡骨髓源树突状细胞体外转化培养
文 章 编 号 ：１ ０ ０ ５ — ８ ５ ６ ７ （ ２ ０ １ ７ ） ０ １ － ０ ０ ３ ４ — ０ ３
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体外培养细胞转化
体外培养细胞转化
第二节 诱变因素的选择
本节内容: 一、诱变剂的选择 二、细胞的选择 三、目前常用的细胞种类
体外培养细胞转化
一、诱变剂的选择
要根据体外培养的细胞而定，这可能与细胞对某种诱变剂 的敏感及其特异受体的存在有关，因此，实验时要根据细 胞特性来选择合适的诱变剂。
第12章 体外培养细胞的转化
体外培养的细胞，有时会发生自发转化，但 这种自发产生的转化时间长，转化率极低， 需用大量细胞，必须用人工诱发的方法。
人工诱发体外培养细胞转化，转化细胞所需 时间短，转化率较高，这对研究癌变原理， 研究可疑致癌因素的作用有很大的实用价值。
体外培养细胞转化
第一节 基本概念和原理
阴性。 （3）、体外传代细胞系最好选用已失去二倍体核
型，已获无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致 瘤性的细胞系。
体外培养细胞转化
三、目前常用的细胞种类
(一)原代细胞：动物细胞以叙利亚幼地鼠和金 黄色地鼠胚胎纤维细胞或幼地鼠肾细胞为佳 ； 人源细胞取自胚胎、小儿包皮及成人真皮纤 维细胞和淋巴细胞等 。
体外培养细胞转化
四、细胞转化的基本过程
１.诱发(Initiation)阶段 ２.DNA的损伤与修复阶段
３.“转化灶”的产生
体外培养细胞转化
１.诱发(Initiation)阶段
诱变剂直接接触细胞 （6小时以上最高不超过24 小时），诱变剂种类多如：
物理因素：如放射线、温度、电磁波、药物等 化学因素：如甲基胆蒽、土醌80、7.12—二甲基
诱变处理和转化阶段
传代所需倍增代数
用致癌剂处理
1
DNA突变的固定和表达
6
筛选和突变克隆形成（转化灶）
12
克隆生长达2×106细胞（克隆扩大培养）
12
传代、克隆再生长，以备研究需要
2
克隆化（纯化） 冻存
24 共57代（约三个月）
体外培养细胞转化
二、转化灶的分离
1、刮除法(1)先在有转化灶的瓶壁上用记号笔圈出记号，倒 掉培养基。
(3)用完全培养基混匀沉淀细胞接种，37℃ 5% CO2培养。数日后， 转ห้องสมุดไป่ตู้细胞迅速增殖成新的细胞群。
转化：只是遗传特性、生长特性、生物学性 状改变，但无致瘤性
恶变：是细胞癌性变，有致瘤性
体外培养细胞转化
三、细胞转化的方式
１．细胞自发转化：体外培养的细胞在无任 何诱变剂存在的条件下，细胞自发出现的转 化现象。
２．人工诱发转化(人工诱变)：在体外培养的 细胞中，常因化学、物理和生物等各种致癌 因素的影响，而使细胞发生转化，转化周期 大大缩短 ，转化率高。
NO1658)； 6、Rat-1； 7、PC-12（ATCC、CRL、 NO1721）； 8、CHO细胞系；9、V79细胞系
体外培养细胞转化
第三节 细胞的转化和转化灶的分离 纯化
本节内容: 一、细胞的转化 二、转化灶的分离 三、转化细胞的筛选
体外培养细胞转化
一、细胞的转化
表１２-１ 诱发突变细胞的细胞转化过程
苯醌(DMBA)、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌(MMS)、 乙基甲磺酸(EMS)、乙基亚硝基脲(ENC)、甲基硝 基亚硝基胍类化合物等； 生毒物、因多素发，瘤如病毒毒素(P、oli黄om曲a)霉、素逆、转病病毒毒S等V40、EB病 促癌剂(Promotor) ：如TPA
体外培养细胞转化
２.DNA的损伤与修复阶段
(5)成单层后，再用消化传代法进行扩大培养。
体外培养细胞转化
2、加套消化法(1)先在瓶壁上用记号笔圈出转化灶，弃掉瓶内培 养液，选生长状态良好的转化灶，用小不锈钢环或玻璃环或硅橡 胶圈，沾少许无菌明胶(不用亦可)套在转化灶上。
(2)向圈中滴入0.25%胰蛋白酶充分消化后，用弯头吸管把胰蛋白 酶与细胞一同吸出，加入3倍新鲜完全培养基混合后，立即低速离 心弃上清。
人胃上皮细胞 人淋巴细胞
适宜用SV40病毒转化； 适宜用EB病毒转化；
地鼠肾细胞
适宜用多发病病毒(Polioma)转化；
C3H小鼠胚纤维细胞 适宜化学致癌物转化。
体外培养细胞转化
二、细胞的选择
选用细胞的原则为： （1）、体外容易培养和传代，克隆形成率高，并
能建立细胞系。 （2）、细胞本身无自发转化能力，动物致癌试验
修复过程中发生修复错误，引起DNA结构的 改变，细胞发生了遗传性改变。
体外培养细胞转化
３.“转化灶”的产生
进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分(大约5%左右)，这 些细胞称为癌前细胞(Precancerous Cell)，均散在未受损 伤的细胞中，随着细胞的继续培养，那些未受损伤的正常 细胞由于接触抑制的限制而停止运动，细胞分裂消失，但 那些散在的癌前细胞由于失去了接触抑制，加上生长繁殖 速度变快，而进行持续不断的分裂增殖，由于在局部癌前 细胞的数量增多而堆积，呈厚厚的多层排列，最后形成了 明显可见的“转化灶”(Focus)，常见有灰白细胞堆积中心点 和放射排列的灶（见书后照片）
体外培养细胞转化
(二)传代细胞系 1、C3H/10T1/2(ATCC、CCL、NO226) 2、3T3-Swiss albsho(ATCC CCL NO92) 3、BALB/3T3(ATCC CCL NO163)等 4、BHK21(ATCC CCL NO10) 5、NIH/3T3-Swiss Mouse(ATCC、CRL、
(2)再用胶皮刮(或用加热的微型电烙器具)在倒置显微镜下去 除未发生转化的圈外正常细胞。
(3)向瓶内加入PBS洗去刮下的细胞，再用0.25％胰蛋白酶 (或0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA1:1混合)置室温消化。
(4)待被消化的细胞略有松动时，翻转瓶底，继续消化，至细 胞松散时，弃去消化液，加入新鲜的10%小牛血清的培养基， 中止消化，并反复用吸管吹打分散，制成细胞悬液，分瓶培 养。
本节内容: 一、细胞转化的基本概念 二、细胞转化与恶变的区别 三、细胞转化的方式 四、细胞转化的基本过程
体外培养细胞转化
一、细胞转化的基本概念
细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞 永生化的转变方式，由限定性细胞系转变成 连续性传代细胞系，获得了永生化。
体外培养细胞转化
二、细胞转化与恶变的区别