抗体纯化大全教学资料
抗体纯化
一、抗体纯化部分1、腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。
1.1 Protein G 抗体纯化步骤：（1）新柱子先用DDW 5ml过柱；（2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱；（3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；（4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱；（5）5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性；（6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱；（7）5倍柱体积20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱；（8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。
其中所用试剂配方：DDW：超纯水Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠61mlB液，0.2M磷酸二氢钠39ml磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.01.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤：（1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5（2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积；b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀；c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解；d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀；e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解；（3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。
抗体ProteinA纯化方法
抗体ProteinA纯化一．P roteinA柱子的制备1.配制溶液；结合／洗涤缓冲液：NaCl，0.5M ；Na2HPO4，20mM ；PH8.0。
配制500ml的方法：称取NaCl 4.383g，Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。
调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。
2. 制备空柱子（1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。
盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。
（2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。
（3）在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。
（4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。
（5）加入5ml的ProteinA到柱子中。
（6）（7）（8）二．纯化步骤1.样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。
2.平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。
3.上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。
4.洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。
5.收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中不含蛋白。
测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。
（注意：收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活）6.柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。
7.PBS透析收集的抗体。
三．试剂的制备1. 结合缓冲液1000ml 500ml甘氨酸112.6g 56.3g氯化钠175.2g 87.6g氢氧化钠调PH至9.02. 洗脱缓冲液500ml甘氨酸7.507g用盐酸调PH至3.03. 再生缓冲液500ml甘氨酸7.507g酸调PH至2.04.称取12.1gTris碱，加80毫升的双蒸水，溶解后用盐酸调节PH8.0，补加到水100毫升，。
抗体纯化手册
抗体纯化手册一、引言概述嘿，小伙伴们！咱们今天来讲讲抗体纯化这事儿呢。
抗体纯化啊，就像是从一堆杂物里把宝贝挑出来一样，超级有趣又特别重要。
在生物研究领域，抗体纯化可是相当关键的一步哦。
二、使用范围说明这个抗体纯化呢，在很多地方都能用得到。
比如在医学研究中，当我们想要研究某种疾病相关的抗体时，就需要把抗体纯化出来，这样才能准确地进行检测、分析啥的。
还有在生物制药方面，纯化后的抗体可以用来制作药物，治疗各种疾病。
三、操作步骤指南1. 样品准备首先得收集含有抗体的样品啦，这个样品可能来自细胞培养上清液，也可能是血清之类的。
收集的时候要小心哦，可不能把样品搞污染了。
就像你从果园里摘水果，要挑那些完好无损的一样。
然后对样品进行预处理，可能需要过滤一下，把那些大的杂质颗粒去掉。
这就像是筛沙子，把大石头筛出去，留下细沙一样。
2. 选择纯化方法有亲和纯化法，这是一种比较常用的方法。
就像磁铁吸引铁屑一样，亲和纯化利用抗体和特定配体之间的特异性结合来纯化抗体。
不过呢，这个方法需要先准备好合适的亲和介质哦。
离子交换纯化法也不错。
根据抗体的电荷性质，让它在离子交换柱上进行吸附和洗脱。
这就有点像按照颜色把小珠子分类，不同电荷的抗体就像不同颜色的珠子。
凝胶过滤纯化法呢，是根据抗体的大小来进行分离的。
大的分子先流出来，小的分子后流出来，就像大的球先从管道里滚出来，小的球后滚出来一样。
3. 进行纯化操作按照所选的纯化方法，把样品加到相应的柱子或者设备里。
如果是亲和纯化，要注意控制流速，不能太快，不然抗体和配体还没结合好就被冲走了。
这就像你浇水的时候，水流不能太急，不然种子会被冲走一样。
在洗脱的时候呢，要选择合适的洗脱液。
这个洗脱液的浓度啊、pH值啊都很重要。
就像调鸡尾酒，各种成分的比例要合适才能调出好喝的酒。
收集纯化后的抗体，要收集在干净、无菌的容器里。
这就像把采到的蜂蜜放在干净的罐子里一样。
四、功能特点介绍纯化后的抗体有很多厉害的地方哦。
抗体纯化方法
抗体纯化方法1. 引言抗体是一类免疫蛋白，具有识别和结合特定抗原的能力。
在生物医学研究和临床应用中，纯化高质量的抗体是非常重要的。
抗体纯化方法可以去除杂质，提高抗体的纯度和活性，从而提高其应用效果。
本文将介绍几种常见的抗体纯化方法。
2. 凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的纯化方法。
该方法利用不同孔径的凝胶过滤介质，将目标分子（如抗体）与较大分子（如蛋白质杂质）分离开来。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使较大分子无法通过凝胶柱而流出。
3.目标抗体由于分子大小适中，能够通过凝胶柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
凝胶过滤层析法的优点是简单易行，不需要特殊设备，且适用于各种规模的实验室。
但其缺点是分离效率较低，只能实现较为粗略的纯化。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化方法。
该方法利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体（如蛋白A、蛋白G等）的亲和层析柱中。
2.目标抗体与配体之间发生特异性结合。
3.使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
亲和层析法具有高选择性和高效率的优点，能够得到高纯度的抗体。
但其缺点是需要特定的亲和剂和配体，成本较高。
4. 离子交换层析法离子交换层析法是一种基于生物分子表面电荷的纯化方法。
该方法利用目标抗体与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。
3.目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液改变pH或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
抗体纯化技术
25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。通常情况下，在24%硫酸铵饱 和度以下很少有蛋白质沉淀下来，而在55%硫酸铵饱和度时会有多数蛋白质沉淀，当硫酸铵饱 和度达到80%以上时，几乎所有的蛋白质都会沉淀下来。
硫酸铵溶解度高，溶于水时产生的热量少，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性。
亲和层析法
概念
利用蛋白质分子对其配体分子的特异识别和可逆结合的特性建立起来的一种有效的分离纯化方 法。
蛋白A/G亲和层析
Protein A/G是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合 的结构域，可结合多种免疫球蛋白的Fc部分，特异性结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化 敏感，会随pH的降低而急剧下降，因此可用于纯化不同来源的抗体及抗体亚型。该法具有极 高的选择性，通常一步层析就可达到超过95%的纯度。
其他沉淀方法
有机溶剂沉淀
概念：利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀.
原理：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 特点：沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂容易除去；易影响蛋白质的活性，故应在低温下操
作并注意搅拌。
聚乙二醇沉淀
概念：在一定盐浓度条件下向溶液加入亲水性极强的聚乙二醇(PEG)引起大分子溶质非特异性 凝聚沉淀的方法。
其他沉淀方法-续
辛酸-硫酸铵沉淀
原理：在酸性条件下（pH4.8）向血清中加入一定量的短链脂肪酸，使血浆蛋白中的清蛋白、 α 及β免疫球蛋白成分沉淀，取以IgG成分为主的上清液再经硫酸铵沉淀得到进一步纯化。
等电点沉淀
概念：利用蛋白质在等电点(pI)时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离 的方法。
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
抗体的纯化与检测详细版
注意事项：选择 合适的荧光标记 抗体避免非特异 性结合
抗体纯化与检测的应 用
疾病诊断
抗体检测：通过检测抗体水平判断疾病状态 抗体纯化：提高抗体检测的准确性和灵敏度 抗体检测的应用：用于诊断多种疾病如传染病、肿瘤等 抗体纯化的应用：提高抗体检测的特异性和灵敏度降低假阳性和假阴性率
药物研发
抗体纯化与检测在药物研发中的作用：提高药物的疗效和安全性 抗体纯化与检测在药物研发中的具体应用：抗体筛选、抗体工程、抗体药物研发等 抗体纯化与检测在药物研发中的技术难点：抗体的纯化、抗体的检测、抗体的稳定性等 抗体纯化与检测在药物研发中的发展趋势：抗体药物的个性化治疗、抗体药物的靶向治疗等
步骤：样品制备、 电泳分离、转膜、 封闭、抗体孵育、 显色、结果分析
优点：灵敏度高、 特异性强、操作 简便、结果直观
应用：广泛应用 于蛋白质表达分 析、疾病诊断、 药物研发等领域
流式细胞术
原理：利用荧光 标记抗体通过流 式细胞仪检测细 胞表面抗原
优点：快速、灵 敏、准确
应用：免疫学、 肿瘤学、血液学 等领域
根据实验目的选 择检测方法：如 定量检测、定性 检测等
实验数据的分析和解读
数据的完整性：确保实验数 据的完整性避免遗漏和缺失
数据的时效性：确保实验数 据的时效性避免过时和失效
实验数据的准确性：确保实 验数据的准确性避免误差和 偏差
数据的解读：根据实验数据 进行合理的分析和解读得出
结论和结论
感谢您的耐心观看
生物科学研究
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 重要性
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 应用实例
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 发展趋势
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 挑战与机遇
抗体纯化的原理和步骤
抗体纯化的原理和步骤抗体纯化，听起来是不是像一门高深的学问？其实，它就是把那些超级英雄般的抗体从一堆“杂质”中找出来的过程。
咱们的免疫系统就像一支警察队，抗体就是那些最勇敢、最聪明的警察，它们专门对付入侵的坏家伙——病毒、细菌等等。
不过，想把这些抗体从复杂的生物样品中提取出来，得有一套“秘籍”！今天，就来跟大家聊聊抗体纯化的原理和步骤，保证让你听得津津有味。
1. 抗体的基本知识1.1 抗体是什么首先，咱们得知道抗体是什么。
这玩意儿其实是由B细胞生产的蛋白质，负责识别和中和外来的侵略者。
可以想象成是专门为打击“罪犯”而生的特工，它们不仅能认得出坏家伙，还能给它们上“刑”。
每种抗体对特定的“罪犯”都有极强的专一性，这让它们在免疫反应中发挥着至关重要的作用。
1.2 抗体的种类抗体可分为多种类型，比如IgG、IgA、IgM等等。
每种都有它独特的功能，就像每位英雄都有自己的超能力。
IgG是最常见的，负责大多数的免疫防御，IgA则主要在黏膜表面发挥作用，像是个“门卫”。
要纯化抗体，了解这些小伙伴的特性可真是必不可少。
2. 抗体纯化的原理2.1 为什么需要纯化好吧，明白抗体是什么后，咱们接下来得搞清楚，为什么要纯化抗体。
想象一下，假如你去参加聚会，周围全是陌生人，你得找到自己的朋友才能安心聊天。
抗体纯化就是这样的过程——把那些“杂质”都清理掉，只留下那些“志同道合”的抗体。
纯化后的抗体才能够更有效地用于科研、治疗等各种用途。
2.2 纯化的方法抗体纯化的方法有不少，比如亲和层析、盐析、透析等等。
亲和层析可以说是个“万里挑一”的高手，它利用抗体和抗原之间的特异性结合，像钓鱼一样，把目标抗体捞出来。
盐析则是利用盐的溶解度差异，让抗体聚集在一起，轻松搞定一部分杂质。
而透析就像是洗衣机，把不需要的“小毛病”洗掉，留下干净的抗体。
3. 抗体纯化的步骤3.1 实验步骤详解接下来，咱们就聊聊具体的步骤吧。
首先，得准备好样品，通常是血清或细胞培养液。
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抗体纯化大全抗体的纯化第一节硫酸铵沉淀法基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
试剂及仪器·组织培养上清液、血清样品或腹水等·硫酸铵（NH4）SO4·饱和硫酸铵溶液（SAS）·蒸馏水· PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一)·透析袋·超速离心机· pH计·磁力搅拌器实验步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。
一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到pH7.0。
此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）；其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；二、沉淀1、样品（如腹水）20 000´g 离心30 min，除去细胞碎片；2、保留上清液并测量体积；3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）；4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。
三、透析1、蛋白质溶液10 000´g 离心30 min（4°C）。
弃上清保留沉淀；2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。
沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
应用提示一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)；2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；3、3000´g 离心30 min（4°C），保留上清液；4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。
将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
参考文献1、 Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma 12, 135.2、 T.G.库珀着，徐晓利主译《生物化学工具》人民卫生出版社出版（1980），353。
（夏泉）表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（S1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨的量（g/L）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 76757 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 64929 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 61930 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58319 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 54612 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 50631 63 97 132 168 205 245 285 375 46932 65 99 134 171 210 250 339 43133 66 101 137 176 214 302 39233 67 103 141 179 264 35334 69 105 143 227 31434 70 107 190 27535 72 153 23736 115 19877 15779第二节 DEAE离子交换层析法基本原理离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。
DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。
纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上，然后用增加盐浓度的方法将抗体洗脱。
可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。
本文以腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。
试剂及仪器·抗体样品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体）· DEAE离子交换剂（阴离子交换剂）·层析柱（2.5cmÆ ´ 20 cm）·缓冲液 A：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl·缓冲液 B：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl·缓冲液 C：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +500 mmol /L NaCl·缓冲液 D：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8· PBS (见附录一)·透析袋 (MW CO 10 000)·磁力搅拌器·蠕动泵和部分收集器·紫外检测仪·梯度发生器·电导仪· pH计·离心机实验步骤整个层析过程最好在4°C 进行,可在冷室操作；1、抗体样品对缓冲液B 透析过夜（4°C）；2、按说明处理DEAE离子交换剂。
然后用缓冲液A 平衡。
用20倍体积缓冲液A洗交换剂，可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A；3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A 中，装入层析柱。
4、用等体积的缓冲液D 稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液A 的离子强度一致；5、稀释后的样品10 000´g 离心10 min（4°C），除去沉淀变性的蛋白质；6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；7、抗体样品以1ml/min 流速上柱，然后用缓冲液A 洗柱1ml/min，将未吸附的蛋白质洗出。
直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05；8、吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱。
用线性梯度缓冲液（35-500 mmol/L NaCl）或分段缓冲液（35、70、140、280、500 mmol/L NaCl）洗脱。
流速1ml/min ，分部收集洗脱液 2ml / 管（图2-4-1）；9、椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。
装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠氮钠)4°C 透析或冷冻（视抗体的稳定性而定）；10、 DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。
图2-4-1 DEAE离子交换柱层析纯化小鼠IgG流速：1ml/min 样品：0.5ml腹水检测方法1、大部分小鼠的单克隆抗体IgG可在50—200mmol/L NaCl浓度之间洗脱。
2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。
实验要点及说明1、要得到满意的分离结果，每ml DEAE 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过10mg。
2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品，可得到更好的纯化结果。
3、如抗体与DEAE离子交换剂不能有效的结合，可将起始缓冲液的pH提高0.1个单位,直到可以有效结合为止。
4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器，可用手工上样和收集。
洗脱液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度计测定各管280nm波长的吸光度值。
5、该方法可按比例扩大。
用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。
参考文献1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、张保真编译西安医科大学出版（1986）《免疫组织化学理论与技术》 69-71。
（夏泉）第三节羟磷灰石层析纯化抗体基本原理羟磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]吸附蛋白质的机理，通常认为与其晶体表面的Ca2+ 和PO43- 两种基团相关。
因为带电基团紧密排列于晶体表面，可能通过偶极子之间的相互作用来吸附蛋白质。
样品被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液（较高浓度的盐溶液）冲洗，可使之解析。
解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动，遇到前面新的吸附剂可再被吸附。
在反复的吸附—解析—再吸附—再解析的过程中，由于待分离物质与吸附剂之间的吸附能力不同，它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同，所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。
抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。
试剂及仪器·抗体样品（腹水或培养上清液）·羟磷灰石（Hydroxylapatite 有售）·层析柱（2.5cmÆ ´ 20 cm）·吸附缓冲液：20mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl·洗脱缓冲液：500mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl· PBS (见附录1)·透析袋 (MW CO 10 000)·磁力搅拌器·蠕动泵和部分收集器·紫外检测仪·梯度发生器·离心机实验步骤1、羟磷灰石柱的准备：将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中，使之充分水合后装柱。