醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究
高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究陈洋;汪超;高冰;李冬生;徐宁;胡勇【摘要】从工业醋醅中分离出5株耐乙醇、耐高温的产醋酸菌株,利用生理生化试验和16S rDNA同源序列分析,初步认定其为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus).通过对其耐乙醇、耐高温发酵特性的研究,发现菌株FY4可耐受体积分数为12％的乙醇和43℃高温,在30℃和体积分数10％乙醇条件下产酸量达到最高,为61.2 g/L.在10L发酵罐试验中,菌株FY4的产酸量始终高于醋酸菌AS1.41,在37℃和体积分数10％乙醇条件下,菌株FY4产酸量达到42.2 g/L,而在此条件下工业菌株AS1.41几乎停止产酸.结果表明菌株FY4具有高耐受性,可产生大量的醋酸,在工业生产中具有潜在应用价值.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2015(034)012【总页数】6页(P28-33)【关键词】巴氏醋杆菌;耐高温;耐乙醇;筛选;深层发酵【作者】陈洋;汪超;高冰;李冬生;徐宁;胡勇【作者单位】湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068【正文语种】中文【中图分类】TS264.2醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡萄糖氧化杆菌属（G1uconobocter）是较为常用的醋酸菌属，前者主要将酒精氧化为醋酸，用于酿醋工业，后者主要将葡萄糖氧化为葡萄糖酸［1-3］。
高考生物《传统发酵技术》专题全覆盖训练题及答案
高考生物《传统发酵技术》专题全覆盖训练题及答案1.(2020江苏单科)某同学在线提交了在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋的实验报告,他的做法错误的是( )A.选择新鲜的葡萄略加冲洗,除去枝梗后榨汁B.将玻璃瓶用酒精消毒后,装满葡萄汁C.酒精发酵期间,根据发酵进程适时拧松瓶盖放气D.酒精发酵后去除瓶盖,盖一层纱布,再进行醋酸发酵2.(2020山东)我国的酿酒技术历史悠久,古人在实际生产中积累了很多经验。
《齐民要术》记载:将蒸熟的米和酒曲混合前需“浸曲发,如鱼眼汤,净淘米八斗,炊作饭,舒令极冷”。
意思是将酒曲浸到活化,冒出鱼眼大小的气泡,把八斗米淘净,蒸熟,摊开冷透。
下列说法错误的是 ( )A.“浸曲发”过程中酒曲中的微生物代谢加快B.“鱼眼汤”现象是微生物呼吸作用产生的CO2释放形成的C.“净淘米”是为消除杂菌对酿酒过程的影响而采取的主要措施D.“舒令极冷”的目的是防止蒸熟的米温度过高导致酒曲中的微生物死亡3.(2020 5·3原创题)我们知道乳酸菌发酵可以酿制酸奶,酸奶可以使用蔗糖、奶粉、蛋白粉等原料进行制作。
下列相关叙述不正确的是 ( )A.蔗糖消耗量与乳酸生成量呈正相关B.酸奶出现明显气泡说明有杂菌污染C.乳酸菌是异养厌氧菌D.列举原料中,只有奶粉为乳酸菌发酵提供氮源4.下列有关腐乳制作的说法中，正确的是 ( )①腐乳的制作主要是利用了微生物发酵的原理，起主要作用的微生物是青霉、曲霉和毛霉②含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳，用含水量过高的豆腐制作腐乳，不易成形，且不利于毛霉的生长③豆腐上生长的白毛是毛霉的白色菌丝，严格地说是直立菌丝，豆腐中还有匍匐菌丝④决定腐乳特殊风味的是卤汤⑤腐乳的营养丰富，是因为其中的大分子物质经过发酵作用分解成小且易于消化的物质⑥卤汤中含酒量应该控制在21%左右，酒精含量过高，腐乳成熟的时间会延长；含量过低，不足以抑制微生物的生长A.①②③④B.②③④⑤C.③④⑤⑥D.①④⑤⑥5.(2016课标全国Ⅱ,39,15分)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
醋酸菌
葡萄酒与醋酸菌梁曼发酵工程2011050783摘要：葡萄酒是一种成分复杂的胶体溶液，从葡萄汁酿成葡萄酒以后，不管是在酒厂的贮藏阶段，还是装瓶以后，它总是在一刻不停地变化着。
由于各种微生物在葡萄酒中的生长繁殖，使得葡萄酒失去了原有的风味，这种现象称为葡萄酒的病害。
在酿酒学领域，醋酸菌几乎不受关注，可能是因为醋酸菌是严格好氧菌，因此人们认为该类菌在葡萄酒中不能生存，除了葡萄酒表面能够永久的与空气接触。
醋酸菌是葡萄酒酿造中的大敌。
凡是有酒花生长之处，就有醋酸菌在一起繁殖；一旦条件具备，会迅速把酒精氧化变成醋酸，使葡萄酒产生醋酸气味，有刺舌感，严重破坏酒质。
在发酵过程中，可通过合理措施来防治醋酸菌的污染。
关键词：醋酸菌；醋酸菌污染；防治措施1葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌1.1醋酸菌的分类醋酸菌是能够将酒精氧化成醋酸的一类微生物的总称。
醋酸菌是多种形态，细胞椭圆到杆状，0.5-0.8×0.9-4.2微米。
单个，成对或成链，不形成孢子。
革兰氏染色阴性。
醋酸菌是专性好氧菌。
有的醋酸菌不会运动，也有具极生或周生鞭毛的运动型。
醋酸菌被分为醋杆菌属（Acetobacter）、酸单胞菌属(Acidomonas)、葡糖醋杆菌（Gluconobacter）、葡糖酸醋酸杆菌（Gluconacetobacter）( Ruiz et al., 2000)。
其中关于各属醋酸菌间的不同（表1），主要区别是葡糖杆菌不能将乙醇最终氧化生成CO2和H2O，而其他属均可。
1.2与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌与葡萄和葡萄酒相关的醋酸菌一般有下列几种：氧化葡糖杆菌、纹膜醋杆菌、巴士醋杆菌、Gluconacetobacter liquefaciens（原来一直被认作是液化醋杆菌）、Gluconacetobacter hansenii（以前一直被认作汉生醋杆菌）。
在未损坏葡萄上发现的醋酸菌主要是氧化葡糖杆菌，菌体数量一般为102-105cells/mL( Du Toit and Lambrechts, 2002)。
红枣醋发酵过程中醋酸菌发酵条件的选择
红枣醋发酵过程中醋酸菌发酵条件的选择原料：红枣菌种：果胶酶，糖化酶，酿酒用活性干酵母，醋酸菌。
工艺流程：原料→拣选→蒸煮→破碎→加果胶酶酶解→加糖化酶糖化→接种酵母菌→接种醋酸菌→过滤→勾兑→调整糖酸比→杀菌→成品操作要点：1.蒸煮时加入原料重量3倍的水，煮至红枣易破碎为止。
同时去除浮在水面已经粘附在红枣表面的蜡质。
2.加果胶酶酶解，酶用量每千克原料，50℃,4小时。
糖化过程，糖化酶用量为%，糖化温度60℃，时间半小时。
3.酒精发酵：先将处理好的原料补加水至总重量为红枣重量的5倍。
酵母菌接种量为kg。
发酵温度28℃，发酵时间7天。
4.醋酸发酵：酒精发酵结束后，接种醋酸菌。
接种量为5%，发酵温度32℃，发酵时间7天。
醋酸发酵结束后用滴定法测其总酸（以乙酸计）：吸取样液5ml(V2)至250 ml三角瓶中，加入蒸馏水45 ml，同时加1％酚酞2滴，摇匀后用0．1 mol／L 氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并保持30 S不褪色为终点，记录氢氧化钠标准溶液消耗的体积(V1)。
同法平行操作3次，算平均消耗体积。
液态样品总酸（g/L）=C×（V1-V0）×K×1000/V2C：氢氧化钠标准溶液的物质的量浓度(mol／L)V0：空白试验消耗氢氧化钠标准溶液的体积(ml)V1：样品滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积(ml)V2：吸取样品的体积(ml)K：乙酸换算系数单因素实验：1.发酵温度对发酵结果的影响：取5份相同量的酒精发酵结束的原料，分别接种5%的醋酸菌，分别置于28℃，30℃，32℃，34℃，36℃发酵，5天后测其总酸。
2.接种量对发酵结果的影响：取5份相同量的酒精发酵结束的原料，分别接种3%,4%,5%,6%,7%的醋酸菌，置于上步所确定的最适发酵温度下发酵，天后测其总酸。
3.发酵时间对发酵结果的影响：取5份相同量的酒精发酵结束的原料，分别接种已经确定的最适接种量，置于最适发酵温度下发酵，从第三天开始每天测其总酸。
醋酸菌的应用及原理
醋酸菌的应用及原理引言醋酸菌（Acetobacter）是一类常见的革兰氏阴性细菌，它们能利用醋酸、乙醇等有机物进行代谢，并产生醋酸。
由于其独特的代谢特性和广泛的应用价值，醋酸菌在生物工程、食品工业和环境保护等领域发挥着重要作用。
本文将介绍醋酸菌的应用及其原理。
醋酸菌的应用醋酸菌在以下领域中得到广泛应用：生物醋生产•醋酸菌通过氧化乙醇生成醋酸，因此广泛应用于醋的生产过程中。
醋酸菌能够在适宜的条件下迅速繁殖，并将乙醇转化为醋酸。
这种发酵过程也被称为醋酸发酵或乙醇酸化过程。
食品工业•醋酸菌可以应用于食品工业中的醋制作。
其独特的醋酸产生能力使得醋酸菌成为酸性食品的理想菌种。
醋酸菌也能够增加食品品质，提高产品的口感和保鲜效果。
酿酒业•醋酸菌在酿酒业中也起到重要作用。
在酿造葡萄酒过程中，醋酸菌起到除酵母菌外的主要嗜酸菌作用。
醋酸菌通过氧化乙醇生成醋酸，能够为酒类提供特殊的香味和风味。
环境保护•醋酸菌在环境保护中也有应用。
由于其对有机物质的吸收和降解能力，醋酸菌被用于处理污水和工业废水中的有机物质。
醋酸菌通过代谢有机物质，并产生二氧化碳和水的同时，减少了有机物质对环境的污染。
醋酸菌的原理醋酸菌的原理可总结为以下几点：•醋酸菌能够利用醋酸、乙醇等有机物进行代谢。
其主要代谢途径为氧化途径。
•醋酸菌含有丰富的醋酸脱氢酶和乙醇脱氢酶，这些酶能够催化乙醇和醋酸的氧化反应，将乙醇转化为醋酸。
•醋酸菌的代谢过程主要发生在胞内，需要适宜的温度、pH和营养条件。
在适宜条件下，醋酸菌能够快速繁殖并产生大量醋酸。
醋酸菌的原理决定了其在醋制作、食品工业、酿酒业和环境保护中的应用潜力。
通过合理地控制醋酸菌的生长环境和营养条件，可以实现对其生长和醋酸产生的调控，从而为相关产业的发展提供支持。
结论醋酸菌作为一类具有特殊代谢能力的革兰氏阴性细菌，广泛应用于生物醋生产、食品工业、酿酒业和环境保护等领域。
其独特的代谢特性和广泛应用价值使得醋酸菌成为这些产业中不可或缺的微生物。
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【摘要】近年来,苹果醋逐渐兴起,但是目前用于苹果醋生产的醋酸菌还存在着各种各样的不足,因此有必要进一步筛选产酸性能好、适应苹果醋发酵的醋酸菌.该研究从自然发酵的苹果醋和苹果园土壤中筛选到19株醋酸菌,菌株YT06,YT10,YT12,YT14和YT17的产酸能力较好,在乙醇浓度为6％时产酸量最大,其中菌株YT17在第8天时产酸量达到27.91 g/L;对这5株菌进行分子生物学鉴定,发现按照亲缘关系分属于3个种:桃醋酸杆菌(Acetobacter persici):YT06;苹果醋杆菌(Acetobacter malorum):YT12,YT14;芝庇侬醋杆菌(Acetobacter cibinongensis):YT10,YT17.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2018(043)010【总页数】5页(P22-25,36)【关键词】醋酸杆菌;苹果醋;筛选;鉴定【作者】李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【作者单位】鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;烟台市粮油质量检测中心,山东烟台 265301;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025【正文语种】中文【中图分类】TS264.22果醋是以水果(包括苹果、葡萄、梨、猕猴桃、柑橘、柿子等)为主要原料，利用酵母菌和醋酸杆菌二次发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，其兼具水果和食醋的营养保健性能，有着巨大的市场潜力[1-3]。
在众多果醋中，苹果醋具有苹果果香，因其富含醋酸、苹果酸、琥珀酸和氨基酸等而使醋的风味独特、酸味适度，同时苹果资源丰富，苹果醋生产工艺简单，使其成为市场占有率最高的果醋产品[4-7]。
醋酸菌发酵条件-概述说明以及解释
醋酸菌发酵条件-概述说明以及解释1.引言1.1 概述醋酸菌是一种常见的微生物菌种，其发酵过程可以产生醋酸和其他有益物质。
醋酸菌发酵条件是指在培养醋酸菌的过程中所需的环境条件，包括温度、湿度、氧气、pH值等因素。
了解和控制这些条件对于提高醋酸菌发酵效率和产量至关重要。
本文将深入探讨醋酸菌发酵条件的关键要点，希望可以为相关领域的研究和应用提供参考和指导。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以包括文章的组织结构和主要内容安排。
在这篇关于醋酸菌发酵条件的文章中，文章结构可以按照以下方式展开:文章结构部分:本文将分为三个主要部分，分别是引言、正文和结论。
1. 引言部分将介绍醋酸菌发酵条件的背景和重要性，以及文章的目的和结构安排。
2. 正文部分将详细探讨醋酸菌发酵条件的相关要点，包括影响发酵的环境因素、最佳发酵条件的探讨和相关研究成果等内容。
3. 结论部分将对文章进行总结，并展望未来关于醋酸菌发酵条件研究的发展方向。
通过以上结构的安排，读者能够清晰地了解整篇文章的内容和思路，帮助他们更好地理解醋酸菌发酵条件的相关知识。
1.3 目的：本文旨在探讨醋酸菌发酵的关键条件，为了提高醋酸菌发酵的效率和产量，我们将深入研究不同条件对醋酸菌发酵过程的影响，并探讨如何优化这些条件。
通过本文的研究，我们希望可以为醋酸菌发酵工艺的改进提供一定的参考，同时也为相关领域的研究提供新的思路和启示。
通过对醋酸菌发酵条件的深入研究，我们可以更好地理解醋酸菌发酵的机制和规律，为相关行业的发展和应用提供更为可靠的科学依据。
2.正文2.1 醋酸菌发酵条件要点1在醋酸菌的发酵过程中，有几个重要的条件需要被满足，以确保醋酸菌能够充分发挥其作用，产生高质量的醋酸。
以下是一些关键的发酵条件要点：1. 温度：醋酸菌的最适生长温度一般在25-30摄氏度之间。
在这个温度范围内，醋酸菌能够更好地进行代谢活动，加快醋的发酵速度。
2. pH值：醋酸菌对环境的pH值要求比较苛刻，一般在3.6- 3.8之间。
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第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
2.2.3醋酸菌的分离纯化2.2.3.1分离纯化实验称取醋醅样品5g，液态增殖培养48h后，按照浓度梯度10-6、10-7和10-8，涂布在分离培养基上，培养2d后，挑取平板上单个透明圈大的菌落。
连续在平板上培养3次，观察其菌落形态是否一致，选取透明圈又大又清晰的单菌落，转接并保藏于4℃的冰箱。
2.2.3.2 革兰氏染色实验将上述活化后的菌株，接种于新鲜的培养基培养24 h，制作水晶镜片进行革兰氏染色。
2.2.3.3产醋酸定性实验[38]取活化好的斜面菌种，分别接种于基础培养基中，并加入3% (v/v) 的无水乙醇，32℃震荡培养60 h，取少量除去菌体的培养液，用NaOH溶液（2.5 mol/L）调节pH至7.0，加入5~6滴5% FeCl3溶液，产醋酸细菌会形成红褐色沉淀。
根据2.2.3.3试验和2.2.3.4试验结果，筛选出革兰氏阴性且产醋酸的细菌[39]为醋酸菌。
2.2.3.4醋酸定量实验经过初步筛选后，把所得菌株接种至发酵培养基中，在32℃、140 r/min恒温震荡培养60 h后，检测其发酵液中总酸，每株平行3组。
醋酸定量测定[40]：精确吸取发酵液2 mL至250 mL三角瓶中，并加入蒸馏水50 mL，滴加1~2 滴0. 5%的酒精酚酞溶液，用已标定过的0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。
产酸量(g/L)=(V-V0)×C NaOH×60/样品毫升数；式中：V=发酵液样品滴定耗用的NaOH毫升数；V0=以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH毫升数；C NaOH=NaOH溶液的浓度(mol/L)；60为醋酸分子量。
2.2.3.5耐酒精能力实验初筛所得的菌株，分别接种到含有无水乙醇的基础培养基中培养，无水乙醇体积分数从5%到14%，每个梯度相差1%，32℃恒温培养3d，观察其是否生长，筛选出耐酒精性能好的菌株。
2.2.3.6传代稳定性实验[41]将上述所筛选出的菌株，每隔一个月，转接纯化后的菌株，连续转接培养7代，并测定其酸度，来判断、筛选，传代最稳定和产醋酸最高的菌株。
2.2.3.7 不同保藏方法保藏醋酸菌的存活期限实验[43]将传代相对稳定性的菌株，分别按照培养基2.2.2中的⑶、⑷、⑸转接，待斜面上菌苔丰厚，保藏于2℃～4℃的冰箱内，每隔三个月再次转接，并观察其存活情况。
2.2.4 菌种鉴定实验[44-45]2.2.4.1培养实验观察通过平板培养，观察菌落形态特征，并挑取单个菌落制做水晶片，革兰氏染色，同时在1000倍光学显微镜下观察其细胞形态、大小和排列特征。
2.2.4.2培养特征实验⑴观察所选菌株在平板上培养的情况；⑵观察所选菌株是否能在高糖培养基上生长；⑶观察所选菌株是否能在Hoyer-Frateur培养基上生长。
2.2.4.3 生理生化实验[46]⑴接触酶的试验：在长势旺盛的平板上，滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。
⑵以铵盐为唯一氮源的生长试验：观察在培养基2.2.2中⑺中生长情况。
⑶GYC培养基产色素试验：观察在培养基2.2.2中⑻上能否生成棕色的水溶性色素。
⑷生酮试验(甘油生成二羟丙酮的试验)：在培养基2.2.2中⑽上，将费林液注满平板，观察菌落周围是否有红色沉淀出现。
⑸产5-酮基葡萄糖酸盐试验：在培养基2.2.2中⑾上，32℃培养24 h后，观察菌落周围是否有白色不透圈。
⑹葡萄糖产酸试验：观察培养基指示剂是否变色。
⑺产纤维素试验：在含糖培养基上向菌落上滴加Lugol碘液和60%硫酸液，观察菌落周围变化情况。
⑻氧化乙酸的能力试验：在培养基2.2.2中⑿上，32℃培养48 h，观察菌落周围是否出现乳白色的晕圈。
⑼氧化乳酸的力试验：在培养基2.2.2中⒀上，32℃培养48 h，观察菌落周是否出现乳白色的晕圈。
⑽在以乙醇为唯一碳源的培养基上，观察其能否生长。
2.2.5 发酵条件实验⑴发酵温度单因素实验以培养温度为梯度，26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，将筛选所得的菌种，分别接种于装有100mL醋酸菌发酵培养基的500mL三角瓶中，置于180r/min的恒温摇床培养72h，以产酸量和醋酸菌数来确定最佳生长条件。
⑵将筛选所得的菌种，分别接种于分离平板上，观察出现透明圈的时间，确定最快产酸时间。
2.3结果与分析2.3.1 分离筛选⑴分离纯化：从分离平板中挑选出107个单菌落菌株。
⑵初步筛选：通过醋酸菌分离培养基筛选，选出44个单菌落产酸菌株。
⑶复筛：又经革兰氏染色和醋酸定性试验，淘汰了革兰阳性及不产醋酸的菌株，选出4株醋酸菌株。
⑷产酸定量试验，筛选出产酸量大最快的菌株，结果见下图2.3.2.A图2.3.1.A 4株醋酸菌产酸量测定Fig 2.3.1.A Four strains in determination of acid acetic acid bacteria⑸耐酒精能力试验，筛选出耐酒精性能好菌株，结果见下图2.3.2.B图2.3.1.B 4株醋酸菌耐酒精测定Fig 2.3.1.B 4 of acetic acid bacteria resistant to alcohol determination⑹然后继续对2株性能较好菌株进行传代培养，确定其传代的稳定性。
每一代产酸量见下表2.3.1.a。
表2.3.1.a 4珠醋酸菌传代培养每代产醋酸的测定(g/L)Tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin)cultivating the determination of acetate(g/L)菌株号X1 X2 X3 X41代38.2 30.9 31.3 41.82代39.4 31.5 31.5 43.43代38.3 30.4 30.1 42.34代37.4 27.3 26.3 40.65代35.1 27.9 22.7 38.76代30.6 24.1 19.5 36.97代28.4 21.8 14.7 35.5由表2.3.1.a可以看出，每代发酵培养中，菌株X4的醋酸产量最高，并在传代培养过程中产量稳定，故选该菌株为目的菌株。
⑺存活期限试验：把X4菌株接入三种斜面保藏培养基，每隔三个月接种到各方法所用的培养基上。
观察其存活情况，见表2.3.1.b：表2.3.1.b三种方法保藏醋酸菌的存活时间Tab 2.3.1.b Three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial时间/月 3 6 9 12 15 18 21 24 斜面法﹢﹣液体法﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹣改进斜面﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢注：“+”表示生长；“++”表示生长良好；”﹣”表示不生长。
从2.3.1.b看可以出，普通斜面保减法保藏的保藏时间小于3个月；而液体保藏法的保藏时间大于18个月；但改进后的斜面液体保藏法，能在20个月内都保持生长良好，且保藏的时间可达24个月。
醋酸菌所产的酸，是造成醋酸菌保藏时间受到限制的原因之一。
随着保藏时间的延长，尽管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直处在酸性环境中，醋酸菌会被自己产的酸所杀灭。
因此，在菌种生长的很健壮后又加入碳酸钙和液体培养基，既降低了氧气的含量，又中和了产生的醋酸，使其在生长和保护方面较液体保藏更加先进了一步，保藏效果也更好。
2.3.2 分析鉴定结果2.3.2.1菌株X4形态特征显微镜下细胞呈椭圆或短杆状，无芽孢，单个或成对、成链排列。
2.3.2.2X4培养特征X4在基础平板培养基上生长旺盛，形成灰白色圆形菌落，表面光滑、凸起，边缘整齐，培养48h能产酸，使CaCO3溶解形成明显的透明圈。