动物细胞大规模培养技术研究进展

仲恺农业技术学院学报,18(3):64~70,2005Jou r na l o f Zhongkai University o f Agriculture an d Technology文章编号:1006-0774(2005)03-0064-07动物细胞大规模培养技术研究进展吴方丽1,金伟波2,王保莉2,3,张涌3(1.西北农林科技大学植物保护学院; 2.西北农林科技大学生命科学学院;3.西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100)摘要:利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品,为提高细胞活力和细胞生长密度,采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞,选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器,在线监控细胞生存环境和生理活动,减少培养过程中培养基的抑制因素,从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因,可减缓细胞凋亡的发生,提高细胞活性和蛋白产量;此外,在动物细胞大规模培养过程中,利用多孔微载体能高效、大量地增殖细胞,具有良好的应用前景.关键词:动物细胞;培养环境;生物反应器;微载体中图分类号:Q251文献标识码:AResearch advance in large-scale culture of animal cellsW U Fang-li1,JIN We-i bo2,W ANG Bao-li2.3,ZHANG Yong3(1.College of Plant Protection; 2.College of Life Sciences; 3.Institute of Bio-Eng i neering,Northwest A&F University,Yangling712100,China)Abstract:Many biological products were manufactured by means of large-scale culture of animal cells.To increase cell-specific productivity and cell density,serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture,and microcarriers were chosen in favor of cell growth and high cell density.Biore-ac tors with simple manipulation,good qualification and aeration were adopted.More suitable conditions for cell gro wth could be given through on-line supervising the environment for cell gro wth and restraint factors in cell culturing.Furthermore,the anti-apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity.Porous microcarriers was emphasized in large-scale culture of animal cells.Key words:animal cell;culture environment;bioreac tor;microcarrier组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪以来,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一.目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上.在动物细胞大规模培养的过程中,最根本的是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻环境对细胞的影响,维持细胞高存活力和高效表达.若以生产蛋白为目的的体外细胞培养,同时还要充分考虑细胞表达产物的后续纯化.收稿日期:2005-04-18基金项目:国家高技术研究发展计划(863)计划资助项目(2001AA21308);西北农林科技大学重点专题基金资助项目.作者简介:吴方丽(1979-),女,河南睢县人,助教,博士.1 细胞最适生长培养基的选择培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素.一般情况下,动物细胞的生长均有赖于血清的存在.但使用血清主要存在潜在的污染源、不同批次间蛋白含量差异大及价格高等弊端[1],给生物制品的生产造成了不便,这就引发了人们对无血清培养基的研究.结果发现,只要在培养基中添加某些适于细胞生长的成分,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等,多种细胞即可在无血清供应的情况下生长[2],尤其是中华仓鼠卵巢(Chinese ha mster ovary,C HO)细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等,其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长最重要的多肽.C HO 细胞能在仅含重组人胰岛素的一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代[3].在人类细胞培养中,某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍.另外,应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长.应用无血清培养基培养动物细胞的成功,还将为某些痘苗的生产降低成本[4].目前,大规模动物细胞培养中已经普遍使用无血清培养基,从而避免了血清培养基污染的可能性,并减少了纯化的难度.但无血清培养基缺乏广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血清培养基配方.如用于基因重组促人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin,r HuEPO)生产且不含牛血清白蛋白的无血清培养基-p (Serum free medium -p,SFM -p)培养液,就是在达尔贝可改良的伊格尔(Dulbecco p s modified Eagle p s medium,DME M)B F12(1B 1)培养基中添加了Se 、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子等成分构成的专用培养基[5].无血清培养基虽然在各个方面都显示出其强大的优势和发展前景,但采用无血清培养而诱发的细胞凋亡也成为动物细胞无血清培养技术中亟待解决的问题.在培养基中加入某些化合物,如金精三羧酸(Aurint ricarboxylic acid,ATA)、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等,在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导致的细胞凋亡[6].但是,由于培养基中所添加的蛋白成分主要还是来源于动物或人,仍然存在病毒污染的危险,只有完全采用非动物来源的材料,才是相对安全的,而植物提取物将是理想的选择.可以这样预测,未来开发的新一代无血清培养基,将是一种既无血清、无蛋白,又可以高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基[7].2 生物反应器的选择在生物制品生产中,动物细胞培养已越来越重要,而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器(也称动物细胞发生器)[8~10].由于动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)在促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)、干扰素(Interferon,IFN)、尿激酶原(Pro -Urokinase,Pro -UK)、疫苗以及其他一些价值昂贵的生物制品的生产上具有独特的优势,因此近年来有关动物细胞生物反应器的研制进展迅速[11~13].目前国内外生物反应器的种类较多,应用于生产实际的也不少,概括下来主要有以下几种:211 机械搅拌式(Spinner)生物反应器机械搅拌式生物反应器是开发较早、应用较广的一类生物反应器,主要由培养罐、管、阀、泵、马达及仪表组成.培养物的混匀由马达带动的不锈钢搅拌系统实现,在罐体顶端还有一些传感器,可以连接监测培养物的温度、pH 值溶氧度(Dissolved oxygen,DO)、葡萄糖消耗、NH 3、NH 4+等参数.这种反应器培养规模可达2000L,若再配合微载体、多孔微球、灌注技术,可使细胞密度达到107/mL 以上,而且消毒方便.另外,其最大的优点是能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合工厂化生产,但不足之处是机械搅拌所产生的剪切力对细胞有一定的损伤[14,15].212 气升式(Air lift)生物反应器气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管,使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环.它在结构上和搅拌式大同小异,其显著特点是用气流代替不锈钢叶片进行搅拌,因而产生的剪切力相对温和,对细胞损伤较小[16].英国Celltech 公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例,该公司在1985年应用100L 气升式生物反应器对杂交瘤65第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展66仲恺农业技术学院学报第18卷细胞进行了大规模培养,现在还开发出了10000L气升式生物反应器用于各类单克隆抗体的规模化生产[17].国内也有人设计制造了10L规模的气升式生物反应器用于培养哺乳动物细胞和昆虫细胞等[18].213中空纤维管(Hollow fiber)生物反应器中空纤维管生物反应器是开发较早且正在不断改进的一类生物反应器.其原理为泵动培养液通过成束的合成空心纤维管(毛细管)而使细胞固着在毛细管内壁上生长.如果毛细管的直径为350L m,表面积B 体积比为30B7,因此大量成束的毛细管内壁提供了大量的细胞生长表面积.中空纤维管生物反应器的用途较广,既可培养悬浮生长的细胞,又可培养贴壁依赖性细胞,并且细胞密度最高可达109/mL[19],主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体.其特点是细胞培养环境温和,培养细胞密度较高,产品较容易分离纯化[20].但这种反应器的培养环境不够均一,在一定程度上影响了产品质量的稳定性.而且,中空纤维培养工艺不易放大,反应器本身的消毒和重复使用也相对较难[21].214旋转式细胞培养系统20世纪90年代中期,美国宇航局(National aeronantics and space administration,NASA)开发了一系列旋转式细胞培养系统(The rotary cell culture system,RCCS),又叫回转式生物反应器(Rotating wall vessel biore-ac tor,RW VB),这是目前世界上培养贴壁和悬浮细胞的最新装置.该系统原先是为保护在宇航中所进行的纤细的组织培养而设计的.然而,它的低剪切力、高物质传递效率和微重力的独特环境,使人们在普通实验室的组织培养箱内也能培养出三维细胞组织[22,23].RCCS是绕水平轴旋转、无气泡的膜扩散式气体交换的培养系统.因该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器,故几乎没有破坏性的剪切力,使得大细胞团得以形成.与普通系统相比,RCCS的一个主要优势是进行能分化或模仿父系组织结构和功能的组织培养.使人们能得到和在人体内一样的培养产物[24~26].由于可模拟空间中的微重力环境,该生物反应器被誉为空间生物反应器.其模拟空间环境的机理是它可使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化,导致一定程度的重力降低,使细胞处于一种模拟自由落体状态,以此模拟微重力环境[27].RCCS由于没有搅拌剪切力的影响,细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长,同时随机化的重力向量可能直接影响细胞的基因表达,或者间接促进细胞的增殖分化和组织器官形成,因而这种生物反应器可用于当前十分热门的组织工程研究,也可用于探索微重力环境对细胞生长、分化的影响[28,29].215其它生物反应器近年来在组织与细胞工程领域用到的还有流化床生物反应器(Fluidized bioreactor)、Petri碟生物反应器(Petri bioreactor)、脉动式生物反应器(Pulsatile bioreactor)、摇床式生物反应器(Shaking bioreactor)、填充床生物反应器(Packed bed bioreac tor)等[9,10,12,30],由于这些生物反应器应用不普遍,故不作详述.3培养用微载体的选择大多数被培养的动物细胞都是贴壁依赖性细胞,而传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或转瓶培养等方式获得,其操作繁复,且耗费空间及人力.1967年,Van Wesel[31]首先提出了/微载体0培养系统,为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了一个新的概念.经过几十年的研究,现在微载体培养已广泛应用于动物细胞的培养,并取得了许多成果.如微载体的大小和电荷量达到了最优化,以提高细胞的生长能力;微载体表面特性的改善,以利于细胞的快速贴壁等.细胞成功地在微载体上扩展的能力随细胞系和培养基的不同而变化,因此为特定细胞选择合适的微载体比选择微载体本身更重要.近年来开始使用的多孔微载体[32]可提供大的表面积B体积和最大的细胞密度[33],然而以该载体培养的有些细胞系却贴在微载体内,其/移动性0相对较差.因此需要研制一种更好的培养方式,以提高微孔的开放性或者改善其表面特性,从而在提高细胞贴壁率的同时增加细胞的移动性.4培养过程的在线监控在动物细胞的大规模培养中,生物离线取样特别是产物浓度测定需要较长的时间,不能及时反映细胞生存环境中的各种参数变化,因而在线过程监控在动物细胞的大规模培养中具有非常重要的地位,可以创造适合细胞生存的最佳环境,减少污染等.目前在培养过程中已经能对温度、pH 值、溶解氧浓度进行在线分析,并可进行有效控制.最近几年,有关细胞培养过程监控的研究迅速增多,在线测量氧吸收速率,可以确定从细胞生长期生产病毒到感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间;用在线葡萄糖分析仪的测定来调整灌流速度等[34].另外,估测目前和未来生物反应过程中葡萄糖的吸收率及乳搪的生成率的软件也已经研制成功[35],这使得对细胞培养过程的状态监控更加及时、准确.5 维持细胞生长所需的最佳条件影响细胞培养的主要因素有C O 2、DO 、温度、pH 值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛、培养基成分等.一般来说,最适C O 2水平为4%~10%,DO 维持在20%~50%,温度一般为37e ,pH 值在710~714之间.葡萄糖是细胞培养过程中的主要能量来源,必须维持在一定水平.氨、乳酸、甲基乙二醛等是动物细胞培养的主要限制因素.氨离子抑制谷氨酰胺(Gluta mine,G1n)的代谢途径,应限制Gln 用量,并尽可能去除培养基中的氨;高浓度乳酸可抑制细胞生长,应降低培养基中的葡萄糖浓度以减少乳酸产生,在动物细胞大规模培养中常常需添加果糖,以减少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基,实际应用中降低甲基乙二醛的浓度主要也是通过降低葡萄糖用量来实现的[7].6 物理场效应对细胞生长的影响各种物理场如静电场、磁场等都会对细胞的代谢产生一定的作用[36,37].物理场对细胞的刺激作用存在阈值,不同的物理场对不同细胞存在不同的场效应.人们目前对各种物理场对细胞的刺激效应有了一定研究,并试图将之应用到动物细胞培养体系之中[38].Bowlin 等[39]证实,细胞经电场作用刺激后,其生理活性有很大的提高,胞外某些物质的含量也明显上升.这说明适当的电场刺激可以提高细胞培养的效率.同时,一定的静电场还有助于细胞产物的分离[40].611 增强细胞抗凋亡能力在动物细胞大规模培养的初期,细胞数量不断增加,表达重组蛋白的能力也在逐步提高.随着细胞数量达到顶峰之后,细胞数量和表达水平将下降.因此,在动物细胞大规模培养的后期,维持细胞的高活力是一个富有挑战性的课题.最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死,而人们逐渐认识到至少有一些细胞系在生物反应器中出现细胞死亡的主要原因是细胞凋亡[7].随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入,细胞凋亡的发生被认为是动物细胞大规模培养过程的重要制约环节,预防并控制细胞凋亡也因此成为研究的热点.用基因工程方法将Bc-l 2这种细胞调亡抑制基因导入细胞,已成为众多学者的选择[41,42].Bc-l 2基因的过量表达能抑制Gln 或氧缺乏引起的细胞凋亡,减少细胞特定营养成分的消耗,提高细胞密度和目的蛋白产量[42,43],这对于细胞大规模培养具有重大意义.但Bc-l 2等抑制基因对细胞的这种保护作用依赖于它的高水平表达,因此,需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因.在动物细胞大规模培养条件下,细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生,因此一种/细胞静止0过程可以有效降低营养成分的消耗和有毒代谢产物的产生,提高CHO 细胞的目的蛋白产率[44],其方法就是向C HO 细胞中导入p21、p27基因,使细胞周期中Gl 期延长(细胞静止).经过如此改造后,细胞活力正常,外源基因表达蛋白量提高,并使产品成本降低,产量提高,遗传稳定性增加[45].612 选择合适的细胞培养工艺流加培养(Fed-batch)和灌流培养(Pefusion)是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式.另外可供选择的方式还有批式-反复流加(Batch-refeeding).虽然许多较老的病毒生产工艺采用批式操作(Batch),新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式,如批式-反复流加或灌流培养工艺.流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器,营养物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡,维持一个高细胞密度和高产物浓度.相对于流加培养,灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并带走代谢产物;同时,细胞保留在反应器中,可以达到很高的细胞密度.与其他方法相比,灌注培67第3期吴方丽,等:动物细胞大规模培养技术研究进展68仲恺农业技术学院学报第18卷养的产率可以提高一个数量级,并可以大大降低劳动力成本[46].灌注培养主要分为悬浮灌注培养和床层灌注培养两大类.悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上,加上一个细胞分离器而成,其中以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见;床层灌注培养则把细胞直接保留于床层,不需要分离器,其中以堆积床和大孔载体培养的应用较广泛[46].流加悬浮培养与灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同,两种操作形式的选择完全取决于每个产品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性,以及产品的最高产量需求和质量要求.7存在问题711无血清培养基适用范围窄目前应用的无血清培养基表现为细胞的适用谱极窄,细胞在无血清培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响,培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便.因此无血清、无蛋白、可高温消毒,且适合于多种不同细胞生长的全能型培养基是未来研制无血清培养基的方向.712固定化培养技术及微载体需进一步探索目前虽然对各种固定化载体某一方面的性能进行了一些改进,但总体上还不能很好地同时满足操作简便、系统稳定、经济适用、生物相容性好以及对细胞的机械保护等诸多要求.因而研制新型的固定化载体以满足上述要求,是动物细胞固定化培养技术继续发展的一个主要方向.在细胞的固定化培养过程中,往往忽略了载体对细胞的生物学作用.即只注意了载体对细胞的机械保护而忽略了载体对细胞代谢过程的影响和调控.尝试研制具有一定生物学功能的细胞固定化载体,是载体研究中一个全新的领域.结合当今最新的纳米技术,可以在载体表面附着一些生物功能性分子,对培养过程进行一定的调节;同时通过不同的生物以及选择不同的加入时间,可望实现培养过程的阶段性调控.但是目前有关这方面的研究仍主要集中在对无机膜的修饰和对无机分子的研究,而有关生物大分子的应用仍处在尚未开发的阶段[47].713生物反应器装置及生产工艺仍需改进目前动物细胞大规模培养中所应用的生物反应器皆有其独特的优点,但同时也存在一定的不理想因素.低或无剪切力,同时还能在线监控的生物反应器是以后研究的重点.另外,动物细胞培养系统在利用新技术、新工艺的同时,还不能协调细胞及其环境与新技术应用的关系.在目前的技术条件下,对这一关系的协调仍旧处于摸索阶段,尚缺乏足够的理论指导.8展望经过几十年来的研究与实践,目前虽然动物细胞大规模培养技术还存在不少问题,但较之几十年前已是质的飞跃.随着这一技术的进一步发展,人们还将不断努力,研制更理想的生物反应器,以获得高密度、高活力的细胞;开发新的无血清培养基,使细胞的生长状态更好,生物制品更安全;建立细胞培养与产物分离的涡合系统,充分利用培养液,以降低生产成本等,从而使动物细胞培养技术在生物制品制备和基因工程等领域得到更广泛的应用.参考文献:[1]VOIGE 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