粟酒裂殖酵母
酿酒酵母与粟酒裂殖酵母属间原生质体融合选育降解苹果酸强的葡萄酒酵母
& 结果与讨论
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3期
高年发等： 酿酒酵母与粟酒裂殖酵母属间原生质体融合选育降解苹果酸强的葡萄酒酵母
7 / F
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粟酒裂殖酵母必需基因省略抑制子的系统筛选和机制研究
粟酒裂殖酵母必需基因省略抑制子的系统筛选和机制研究在单细胞物种中,必需基因可被简单定义为在正常培养条件下对细胞生长所必需的基因。
因此必需基因常控制细胞内核心的生物学过程,也在不同物种间具有很高的保守性[1]。
功能基因组学的研究表明,有些基因在不同的物种间显示出不同的必需性[2],这表明基因的必需性受遗传环境影响。
遗传学实验还曾发现某些必需基因缺失造成的致死表型可以被单个突变所挽救,这种突变被称为省略抑制子。
为系统研究省略抑制现象,我们在粟酒裂殖酵母S. pombe中对其TT号染色体左臂的165个必需基因开展了省略抑制子筛选。
在本课题中,我们通过覆盖几乎整个基因组的过表达质粒文库观察单个基因的过表达对必需基因缺失的弥补性影响。
我们首先在S. pombe中建立了一套可靠的筛选过表达省略抑制子(overexpression-mediated bypass-of-essential-gene (0-BOE) suppressors)的方法,并成功对128个必需基因进行了O-BOE的筛选以及鉴定。
通过我们的实验结果,我们发现在S. pombe的基因组中,约12.5%的必需基因缺失的致死表型能被单个过表达质粒所挽救(省略抑制)。
而大部分必需基因都筛选不到过表达省略抑制子,这表明细胞内的必需基因不是同等重要的。
通过分析我们发现有0-BOE抑制子的必需基因与没有O-BOE 抑制子的必需基因相比,基因的进化速率更快,在不同物种间的保守性更低。
同时,在蛋白质相互作用的网络中,这些基因也不倾向成为网络中的中心,和形成聚集的模块。
这表明这些可被省略抑制的必需基因,在特征上更接近非必需基因。
通过分析过表达省略抑制相互作用的模式,我们发现编码同一个蛋白复合体中不同蛋白的必需基因,或者在相同生物学通路中起作用的必需基因的过表达省略抑制子之间会出现交集,这表明系统性的省略抑制子研究有可能帮助我们找到必需基因相互作用的模块。
而我们进一步的分析表明,过表达省略抑制遗传相互作用有助于揭示基因的必需生物学功能,如resl可被Cdc18过表达省略抑制,这表明resl的必需功能可能是在细胞周期的G1/S转变过程中激活Cdc18的转录；同时我们发现多个磷脂酶的过表达可以省略抑制ERMES (ER-mitochondria encounter site)复合体中的基因,这意味着ERMES复合体的必需功能与脂质的调控有关；同时过表达省略抑制相互作用可将不同的生物学过程之间建立联系,比如线粒体核糖体亚基mrp21与mrps28的缺失可被参与小分子RNA代谢过程的Dcr1省略抑制提示线粒体功能与小分子RNA之间可能存在联系。
粟酒裂殖酵母中Mpa1定位及功能的研究
粟酒裂殖酵母中Mpa1定位及功能的研究线粒体是真核生物进行氧化代谢,糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所,为细胞的生命活动提供能量,是细胞氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,有细胞“动力工厂”之称。
另外,线粒体有自身的DNA和遗传体系,但基因组的基因数量有限,因此,线粒体只是一种半自主性的细胞器。
线粒体的表达障碍直接导致各种各样的疾病,如何治疗线粒体疾病成为目前的研究重点。
许多研究表明,线粒体功能异常与帕金森氏症、阿尔兹海默病、糖尿病、肿瘤的发生发展过程密切相关,既是疾病病因之一,又是疾病发病的早期征兆。
因此研究线粒体基因表达机制,可以为治疗线粒体基础疾病提供帮助。
Mpal 是我们实验室通过串联亲和纯化(Tandem affinity purification)、免疫共沉淀和质谱(mass spectrometry)鉴定技术,发现的与Ppr10有体内相互作用的蛋白。
mpa1是未被研究过的一个新颖的基因,因而本研究选择mpa1基因作为研究对象。
接下来,本研究将对Mpa1的相关功能做进一步研究。
借助在线工具MitoProtⅡ(https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析结果得知,Pprl0含有线粒体的定位信号肽,但是无法预测到Mpa1的线粒体定位信号肽。
由于Mpa1与Ppr10蛋白存在体内相互作用,猜测Mpa1与Ppr10共定位。
为了进一步明确Mpa1的定位,对Mpa1做了亚细胞定位,最终确定Mpa1定位于线粒体基质。
为了研究Mpa1的相关功能,首先以单倍体酵母菌株yHL6381为出发菌株构建了mpa1基因缺失突变株。
接下来,针对突变株进行了一系列的表型研究：包括生长曲线测定,细胞形态观察,不同生长阶段的存活能力、在基础培养基和非发酵性培养基上的生长状况及对线粒体呼吸链抑制剂抗霉素A的敏感性研究。
表型研究结果表明,mpa1基因缺失突变株在与呼吸功能相关的培养基上呈现出生长缺陷,并且在生长阶段后期生存能力严重受损。
粟酒裂殖酵母全基因组中含信号肽的蛋白质的研究
DOI: 10.1360/yc-007-0250
研究报告
粟酒裂殖酵母全基因组中含信号肽蛋白质的研究
刘玉岭, 柳云帆, 谢建平
西南大学生命科学学院现代生物医药研究所, 重庆 400715
第 29 卷
Signal P 3.0
195 N-terminal signal pepetide-containing proteins proteins proteins
的肿瘤药物的理想细胞初筛模型, 其遗传背景清晰, 遗传操作方便。S. pombe的全基因组序列测定于 2002 年完成[1], 基因组大小为 13.8 Mb, 分布在染色
收稿日期: 2006-06-14; 修回日期: 2006-09-06 基金项目: 教育部科学技术研究重点项目(编号: 105146)和西南大学 211 建设项目(微生物学)[Supported by Key Project of MOE S&T(No. 105146)
and 211 Key Microbiology Project of Southwest University] 作者简介: 刘玉岭(1981—), 女, 山东泰安人, 硕士研究生, 研究方向: 粟酒裂殖酵母功能基因组学与药物筛选模型。Tel: 023-68253392; E-mail:
lyling@ 通讯作者: 谢建平(1971—), 男, 重庆人, 博士, 研究员, 研究方向: 工业(药用)微生物功能基因组学与新药筛选。Tel: 023-68254062; E-mail:
利用 TMpred (/software/ TMPRED_form.html)分析跨膜结构。
粟酒裂殖酵母snR88和U18snoRNA的功能分析的开题报告
粟酒裂殖酵母snR88和U18snoRNA的功能分析的开题报告1. 研究背景粟酒裂殖酵母是一种常见的单细胞真核生物，广泛应用于生物技术领域。
在生物合成过程中，snR88和U18snoRNA是两种重要的RNA分子，与整个合成过程密切相关。
尽管这两种RNA分子已被广泛研究，但它们的精细调控机制仍未完全明确。
因此，对snR88和U18snoRNA的功能进行深入研究具有重要意义。
2. 研究目的本研究旨在探究snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母中的功能及其相互作用机制。
具体包括以下几个方面：（1）探究snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母中的表达情况及其对基因表达的影响；（2）分析snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母中的稳定性及其稳定机制；（3）研究snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母细胞中的互作关系。
3. 研究方法（1）RNA干扰：通过RNA干扰技术抑制snR88和U18snoRNA的表达，观察其对粟酒裂殖酵母生长和基因表达的影响。
（2）RNA稳定性实验：通过荧光素酶报告基因技术构建snR88和U18snoRNA的稳定性实验系统，分析这两种RNA分子的稳定机制。
（3）RNA互作实验：通过RNA交联免疫沉淀实验探究snR88和U18snoRNA之间的相互作用关系。
4. 预期结果（1）研究将揭示snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母中的表达情况及其对基因表达的影响。
（2）研究将探究snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母中的稳定性及其稳定机制。
（3）研究将揭示snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母细胞中的互作关系。
通过本研究，将进一步了解snR88和U18snoRNA在粟酒裂殖酵母中的生物学功能，为生物技术研究提供新思路和理论基础。
粟酒裂殖酵母 酿酒酵母 库氏毕赤酵母 拜尔接合酵母
粟酒裂殖酵母酿酒酵母库氏毕赤酵母拜尔接合酵母
粟酒裂殖酵母
粟酒裂殖酵母，是一种特殊的酿酒菌，它能够在有限的条件下产生大量乳酸和乙醇等有益成分，这样就可以使酒精含量达到15-20%，并且口感优美、口味醇厚。
它是一种极其特殊的菌株，能够在低温下保持良好的发酵状态，而且能够改变酒的风味，使之变得更加醇厚浓郁，更易于饮用。
它在全球范围内被广泛应用于各种白酒、啤酒、黄酒、糖酒及其他酒类酿造中。
酿酒酵母
酿酒酵母是指用于酿造酒精饮料的一种酵母菌，它能够将糖分解成酒精和二氧化碳，从而使糖变成酒。
它是一种特殊的酵母菌，有着独特的性质，能够在低温、低pH和低溶解氧条件下保持良好的发酵状态，能够有效地改变酒的风味，使之变得更加醇厚浓郁，更易于饮用。
它主要被用于制作白酒、啤酒、黄酒、米酒、果酒等酒类，其发酵效率及产酒量也不同。
库氏毕赤酵母
库氏毕赤酵母是一种独特的发酵酵母，它是由美国德克萨斯州的一名发明家库氏发现的，后来被命名为“毕赤”。
它能够在低温、低盐分及低pH条件下发酵，具有良好的抗稳定性，发酵效率高，极高的产酒量，而且能够改变酒的风味，使之变得更加醇厚浓郁，更易于饮用，因此在全球范围内被广泛应用于各种白酒、啤酒、黄酒、糖酒及其他酒类酿造中。
拜尔接合酵母
拜尔接合酵母是一种改良型的酵母，它是一种同时兼具发酵和抗稳定性的特殊菌株，与一般的酵母相比，拜尔接合酵母具有更高的抗稳定性，发酵速度更快，产酒量更高，由此可以使酒精含量达到15-20%，并且口感优美、口味醇厚。
它主要被用于各种白酒、啤酒、黄酒、糖酒及其他酒类酿造中，其发酵效率和产酒量也与库氏毕赤酵母相当。
裂殖酵母的比较功能基因组学
裂殖酵母的比较功能基因组学裂殖酵母菌属包括粟酒裂殖酵母，八胞裂殖酵母(S. octosporus)，嗜冷裂殖酵母(S. cryophilus)和刺参裂殖酵母(S. japonicus)。
它们占了子囊菌纲的大体分支而且是真核细胞生物学的一个重要模型。
比较这些基因组的注释，咱们发现了濒临灭绝的转座子并展开了自由转座子着丝粒方面的创新。
表达分析肯定了减数割裂基因在营养生长期服从反义转录，这表明了它们严格的调控机制。
另外，反式作用调节因子可控制扩展功能模块范围内的减数割裂和应激反映的新基因。
基因的内容和调控的不同可以解释为何不同于酵母菌亚门的芽殖酵母，裂殖酵母不能利用乙醇作为主要的碳源。
这些分析阐明了裂殖酵母的基因组结构和基因调控并为整个裂殖酵母菌属的研究提供了工具。
裂殖酵母菌种裂殖酵母在具有不同凡响的生活史的子囊菌（图1A）里形成了一个普遍而古老的群体(1)。
裂殖酵母作为单倍体优先生长，以二割裂而不是不对称出芽的方式增殖，而且已形成了一种独立于芽殖酵母（酵母菌亚门）的单细胞生物生活方式。
裂殖酵母与后生动物拥有许多相同的重要生物进程，包括染色体的结构和代谢——染色体相对较大，多重复性的着丝粒，低复杂度的复制起点，异染色质组蛋白甲基化修饰，染色质异染色质蛋白，小分子干扰RNA(siRNA)调控的异染色质，和TRF家族端粒结合蛋白——G2/ M细胞周期调控，细胞割裂，线粒体的翻译密码子，RNA干扰(RNAi)途径，信号传导体途径和剪接体的组成。
这些特点在芽殖酵母中缺失或高度分化。
一般情况下，比起其它的子囊菌纲，裂殖酵母的核心同源基因更接近于后生动物(2)。
裂殖酵母也在碳源代谢进化上产生创新，包括葡萄糖有氧发酵成乙醇(3)。
这种趋同进化的芽殖酵母酿酒酵母为复杂表型的进化提供了深切了解。
粟酒裂殖酵母被普遍利用作为研究细胞中大体生物进程和与人类疾病相关基因的模型。
为了更好地了解它的进化和自然历史，咱们比较了所有已知的裂殖酵母——粟酒裂殖酵母，八胞裂殖酵母，嗜冷裂殖酵母和刺参裂殖酵母——的基因组和转录。
粟酒裂殖酵母菌体形态
粟酒裂殖酵母菌体形态
粟酒裂殖酵母菌体形态是一种多形态的酵母菌，其形态和类型是不同的。
它们体形像一个小球，有着似棒棒糖般的卷曲但是没有翅膀。
头部和
腹部有明显的分界，且会发生变形。
表面覆盖有大量细胞壁和脂肪质，胞
浆含有较多的蛋白质、糖、碳酸钙和氨基酸。
粟酒裂殖酵母菌一般分布在
粮食、水果、蔬菜和谷物等多种原料中，可以用作酿酒、面包烘焙等多种
食品加工的材料。
可以向管道中倾注水和温度控制，可以预防并且控制粟
酒裂殖酵母菌的生长。
粟酒裂殖酵母菌具有多种同系异构体，不同的温度
环境中不同的形态可以得到，可以根据实际需要选择最佳形态。
粟酒裂殖
酵母菌量子云粒子都比较小，在视野中可以单独观察到，但是数量又很多，彼此之间排列着，堆叠起来，形成了一个漂亮的菌体形态。
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索取号：密级：加密tRNA（transfer ribonucleic acid）3′端加工成熟过程，是指剪切掉tRNA前体3′端的多余碱基序列以及在其末端添加CCA的过程。
只有加工成熟后的并带有3′CCA末端的tRNA才能进行氨基酰化，执行其在蛋白合成过程中的功能。
真核生物、古生菌和一些细菌的tRNA基因不编码3′末端CCA，其CCA需要在tRNA3′末端加工成熟后再添加上去，这类tRNA的3′末端的加工成熟需要核酸内切酶tRNase Z参与。
粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyce spombe中含有两种tRNase Z基因：sptrz1+ (SPAC1D4.10) 和sptrz2+(SPBC3D6.03c)，它们编码的蛋白分别定位于细胞核和线粒体中。
本实验组已经证实两种tRNase Z都是必需基因。
我们已经完成了对sptrz1+的功能的相关研究，本实验的主要内容是得到一株sptrz2+的温度敏感型突变菌株，并利用该菌株进行SpTrz2p功能的相关研究。
在我们实验进行的过程中,冷泉港实验室Danielle V.报道sptrz2-A623V的突变会使菌株产生温度敏感的表型。
本实验中，我们把sptrz2-A623V突变引入到遗传背景比较清楚的菌株S. pombe yAS56中的，得到具有温度敏感型的菌株tsD。
根据对tsD中sptrz2-A623V的基因型进行测序鉴定以及带有sptrz2+的外源质粒限制性温度下救活实验的结果，我们确认tsD即为sptrz2+的温度敏感型菌株，可以用于对SpTrz2p相关功能的进一步研究。
我们也对温敏菌株sptrz2+加标签实验，选择了三种标签：HA、3HA、GFP，从而可以利用western技术跟踪细胞内SpTrrz2蛋白的表达量。
得出温度敏感型菌株产生的原因，但是在实验过程中发现标签对Sptrz2p蛋白功能有影响：HA、3HA对蛋白功能的影响较GFP严重。
我们成功的给野生型s.pombe Yas56 加上了GFP标签，但无法给温度敏感型菌株加上标签，我们进而采用重组蛋白的方法制备Sptrz2p的抗体。
关键词：S. pombe，tRNase Z，温敏菌株，GFPAbstracttRNA 3'-end maturation is a process through which the 3'-trailer sequence of precursor tRNAs (pre-tRNAs) is removed, and processed tRNAs acquire the CCA end which is absolutely essential for tRNA aminoacylation and protein synthesis. As for eukaryotes,archaea and some bacteria, the 3'-CCA sequence is not genomically encoded. The 3'-trailer sequence of pre-tRNAs is removed by tRNase Z and the 3'-CCA tail is added post-transcriptionally.In Schizosaccharomyces pombe there exists two tRNase Z genes, designated sptrz1+(SPAC1D4.10) and sptrz2+(SPBC3D6.03c), encoding the nuclear and mitochondrial tRNase Zs, respectively. In our previous study, we have demonstrated that both of the two tRNase Zs in Schizosaccharomyces pombe are essential. We have carried out studies on sptrz1+ and drawed some definite conclusions. In this study, we intented to obtain a ts strain of sptrz2+ and carried out studies on the function of it.During our research work, we learned about that the sptrz2-A623V mutation induced temperature-sensitive phenotype to the strain DI13, which was discovered by the Dirvine from Cold Spring Harbor Institute. We asked Dirvine for the plasmid with trz2-A623V .Other members in our laboratary inserted the kanMX6 gene into the vector to construct the targeting vector pBSⅡK -sptrz2-kanMX6. Then we introduced the trz2-A623V mutation into S.pombe yAS56 and obtained our ts strain tsD. After a series of testing experiments, such as phenotype verification, genotype verification and complementation of the temperature-sensitivity by sptr2+, we drawed the conclusion that tsD was the very ts mutation strain that could be used for further fuctional complementation study on sptrz2+.Key words: S. pombe, tRNase Z, ts strain, high-copy suppressor gene第1章综述tRNA（transfer ribonucleic acid）是携带并转运氨基酸到核糖体上，在mRNA指导下合成蛋白质的一类小分子核糖核酸。
tRNA的研究是分子生物学中一个重要而且活跃的研究领域。
在所有的真核生物体、古生菌和一些细菌体内，tRNA分子先转录形成前体，经过一系列的加工后成为具有功能的成熟tRNA分子 。
这些加工步骤包括去除5'前导序列、3'末端序列、切除内含子、进行碱基修饰等[2-3]、添加末端CCA(主要在真核生物中)如图1.1)。
目前tRNA分子5'端加工机制已研究得比较清楚，而其3'末端的加工还在进一步研究中。
tRNase Z（transfer RNA (tRNA) 3'processing endoribonuclease）是一种催化tRNA前体3'末端加工成熟的核酸内切酶。
tRNA3'末端的加工在1979年就已发现[4]，但相应的内切酶及基因序列直到2002年才被发现[2]。
这种蛋白最早是从小麦中纯化出来的，根据其序列在三界（细菌、古生菌、真核生物）中鉴定出了众多的同源物[5]。
这种新的酶被命名为tRNase Z。
1.1 tRNA前体3'末端的加工tRNA前体3'末端的加工途径取决于tRNA前体3'末端是否含有CCA序列[6-10]。
已知在所有的生物中，只有3'末端带有CCA序列的tRNA才能在tRNA-氨酰合成酶作用下氨基酰化，并行使其功能。
1.1.1 原核生物tRNA 前体 3'末端的加工在原核生物体中，有些tRNA基因编码末端CCA序列，而有些则不编码末端CCA序列。
末端含有CCA序列的tRNA前体其3'末端CCA下游序列主要由核酸外切酶剪切，而末端不含有CCA序列的tRNA前体的3'末端则由核酸内切酶tRNaseZ加工完成产生此过程，然后才能在tRNA 核苷酸转移酶的作用下正确添加CCA序列。
目前对大肠杆菌Escherichia coli和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis tRNA前体3'末端的加工研究最为透彻[9][11-12]。
Escherichia coli所有的tRNA基因都编码末端CCA序列，这些tRNA前体3'末端的成熟主要由核酸外切酶RNase T和RNase PH加工完成[9,12]。
Rnase D,RNase BN和RNase Ⅱ等核酸外切酶也可参与切除3'末端序列，其活力比较低[12]，但也有内切酶参与到其中（图1.2B）。
在Bacillus subtilis中，约有三分之二的tRNA基因编码末端CCA序列，含有末端CCA序列的tRNA前体3'末端的加工类似于E.coli中的tRNA 前体3'末端的加工，而不含有末端CCA序列的tRNA前体3'末端的加工则是由核酸内切酶tRNase Z完成。
tRNase Z能在“区别碱基”（discriminator nucleotide，位于CCA 5' 的未配对核苷酸）后精确切割tRNA前体3'末端序列。
CCA是tRNase Z 内切酶活性的强抑制子，可以防止CCA被反复合成和切除[8,13]。
但有一种特殊的细菌海栖热袍菌Thermotoga maritima中tRNase Z可以切除到CCA的3'端，T. maritima有46个tRNA基因，其中有45个编码CCA序列，这45个tRNA前体3'端加工时由TmaTrz在CCA的3'端进行剪切，将CCA留在tRNA 3'端(图1.2B)；一个不编码CCA序列的是tRNA Met，由TmaTrz在“区别碱基”后进行切割。
TmaTrz将CCA motif作为了切割的指导序列而不是被其抑制[14]。
在古生菌（archaea）中，绝大多数tRNA 基因不编码末端CCA序列，tRNA前体3'末端的加工由核酸内切酶tRNase Z完成[5]。
1.1.2 真核生物tRNA 前体 3'末端的加工相对于原核生物体，我们对真核生物体中的tRNA前体3' 末端加工机制的研究尚处在初步阶段。