裂殖壶菌油脂提取方法的研究

第30卷第6期温州大学学报·自 然 科 学 版2009年12月V ol 30, No 6 Journal of Wenzhou University · Natural Sciences Dec, 2009 裂殖壶菌油脂提取方法的研究马建设1，韩方方1，叶海仁2，周茂洪2，黄可新1，赵肖为2,†(1．温州医学院药学院；2．温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)摘要：比较了有机溶剂提取法、酸热法和超声波提取法对于裂殖壶菌油脂的提取能力．酸热法和超声波提取法的提取得率高于有机溶剂提取法．当氯仿和甲醇以1∶1的体积比混合时，油脂提取得率最高．当氯仿和甲醇以2∶1的体积比混合时，提取所得油脂中的DHA含量最高．但总提取得率还是以氯仿和甲醇的体积混合比为1∶1时为最佳．关键词：裂殖壶菌；油脂；酸热法；有机溶剂提取法；超声波提取法中图分类号：TS224 文献标志码：A 文章编号：1674-3563(2009)06-0021-04DOI：10.3875/j.issn.1674-3563.2009.06.004 本文的PDF文件可以从获得裂殖壶菌（Schizochytrium）正在成为工业化生产DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid）或者富含DHA的油脂的重要菌种[1]．国内外已有许多关于提取微生物油脂的研究报道，李植峰等人[2]比较了索氏法、超临界CO2萃取法、酸热法和有机溶剂法从雅致枝霉（Thamnidium elegans）、拉曼被孢霉（Mortierella ramanninace）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）和畸雌腐霉（Pythium irregulare）等微生物中提取油脂的效果，认为酸热法快速、简便、有效，但对二十碳以上的长链脂肪酸的提取能力有待进一步考察．本文研究从裂殖壶菌提取油脂（特别是二十碳以上的长链脂肪酸）的方法．1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌体菌体由裂殖壶菌（Schizochytrium）WZU4771[3]经发酵、冷冻干燥而得．1.1.2 试剂DHA甲酯、花生酸甲酯和花生酸购自美国SIGMA公司；正己烷、甲醇、氯仿和三氟化硼-乙醚等试剂均为市售国产分析纯．1.2 油脂提取方法1.2.1 有机溶剂提取法[4]称取一定量的菌体至圆底烧瓶中，加入一定比例的氯仿-甲醇混合溶剂，65℃水浴回流2 h，收稿日期：2009-05-20基金项目：浙江省科技计划项目(2007C22G2250004)作者简介：马建设(1982- )，男，河南武陟人，硕士研究生，研究方向：生物化工．† 通讯作者，sherwood@wzu. 温州大学学报·自然科学版(2009)第30卷第6期 22过滤，残渣再用一半体积的氯仿-甲醇混合溶剂回流1 h，过滤，合并滤液，挥发除去溶剂，50℃真空干燥至恒重，称量．1.2.2 酸热法[2]称取一定量的菌体，按每克6 mL的比例加入4 mol·L-1盐酸，振荡混匀，室温放置30 min后，沸水浴煮3 min，–20℃速冷后加入2倍体积的氯仿-甲醇混合溶剂，充分振荡后，5 000 r·min-1离心5 min，取氯仿层，加等体积的0.1%氯化钠溶液，混匀，5 000 r·min-1离心5 min，取氯仿层移至干燥的试管中，挥发除去氯仿，得到油脂，然后50℃真空干燥至恒重，称量．1.2.3 超声波提取法[5]称取一定量的菌体至离心管中，加入一定比例的氯仿-甲醇混合溶剂，超声粉碎15 min，加入一定比例的蒸馏水，涡旋混匀后离心（5 000 r·min-1离心5 min），取氯仿层，加等体积的0.1%氯化钠溶液，混匀，5 000 r·min-1离心5 min，取氯仿层至干燥的试管中，挥发除去氯仿即得油脂，50℃真空干燥至恒重，称量．1.3 油脂中DHA含量的测定[6]适量油脂按一定比例加入KOH-甲醇溶液（0.5 mol·L-1），65℃水浴加热，待油脂溶解后，加入一定量内标物花生酸与三氟化硼-乙醚，继续加热反应．冷却至室温，加入1 mL正庚烷，混匀，再滴入适量的饱和氯化钠溶液，混匀，静置分层后取上层，用无水硫酸钠脱水，再进行气相色谱测定．色谱条件：岛津GC-14B型气相色谱仪，色谱柱：AT. ov-1701（30 m ×250 μm ×0.33 μm，兰州中科凯迪化工新技术有限公司）．采用程序升温，初始温度180℃，保持2 min，然后按5℃·min-1升到240℃，保持16 min；进样口温度250℃；FID检测器，检测器温度260℃．2 结果与讨论2.1 3种方法对裂殖壶菌油脂的提取得率由表1可知，有机溶剂提取法的提取得率比酸热法和超声波提取法的低得多，而酸热法和超声波提取法的提取得率接近．裂殖壶菌在胞内积累油脂，在细胞壁完整的情况下，有机溶剂无法很好地提取油脂．单纯依靠有机溶剂不能很好地破坏细胞壁，而酸热法所使用的盐酸以及超声波粉碎能够充分地破坏细胞壁，从而提高提取得率．2.2 氯仿与甲醇的混合比例对提取得率的影响无论是超声波提取法还是酸热法，均采用氯仿和甲醇的混合物作为溶剂来提取裂殖壶菌细胞中的油脂，氯仿与甲醇的混合比例对提取得率的影响见表2．由表2可知，在相同的混合比例下，2种方法的提取得率相近．氯仿和甲醇的混合比例为1∶1时，提取得率最高．表1 不同方法的提取得率Table 1 Extraction Efficiency of Different Methods提取方法提取得率 / %酸热法 72.58±2.07 有机溶剂提取法 46.59±0.84超声波提取法 72.90±4.61表2 氯仿和甲醇的混合比例对提取得率的影响Table 2 Effect of Mixing Ratio of Chloroform andMethanol on Extraction Efficiency提取得率 / %氯仿∶甲醇(v / v) 超声波提取法酸热法1∶2 68.01 ± 2.68 68.97 ± 3.111∶1 72.90 ± 4.61 72.58 ± 2.072∶1 68.68 ± 1.28 67.26 ± 1.26马建设等：裂殖壶菌油脂提取方法的研究232.3 氯仿与甲醇的混合比例对提取所得油脂中DHA 含量的影响由表3可知，无论是酸热法还是超声波提取法，采用相同比例的氯仿-甲醇混合溶剂，提取得到的油脂中的DHA 甲酯含量基本相同．但随着氯仿比例的增加，DHA 含量增加．这可能是由于DHA 的碳链较长、极性较小，随着氯仿比例增加混合溶剂的极性变小，更易于萃取出DHA ．但是如果仅用氯仿来萃取油脂，油脂得率只有34.74%，溶剂极性过小反而不利于油脂的提取，这可能和甘油中脂肪酸的种类有关．尽管当氯仿和甲醇的混合比例为2∶1时，提取得到的油脂中DHA 含量最高，但是，此比例的混合溶剂的油脂得率不高，总提取效率还是以氯仿和甲醇的混合比例为1∶1时为最佳． 2.4 裂殖壶菌油脂的气相色谱图图1为采用酸热法从裂殖壶菌中提取得到的油脂的气相色谱图．裂殖壶菌油脂的组成比较简单，不含EPA （二十碳五烯酸，Eicosapentaenoic Acid ）．一般来说，鱼油中EPA 含量比DHA 的高，但是EPA 可能引起出血，所以在婴儿食品中不得添加[1]．由于EPA 和DHA 的结构非常相近，所以很难分离，或者分离的成本非常昂贵．本文提取得到的油脂不含EPA ，这种油脂特别适用于婴儿食品．3 结 论有机溶剂提取法操作简便，但费时，提取效率亦较低；超声波提取法的提取效率比较高，但是其需要有专门的设备．因此，从样品处理能力、设备要求、提取得率及油脂中DHA 含量等方面综合考虑，从裂殖壶菌中提取油脂以酸热法最为适宜，该法能够很好地提取长链脂肪酸．表3 氯仿与甲醇的混合比例对提取所得油脂中DHA 含量的影响Table 3 Effect of Mixing Ratio of Chloroform and Methanolon DHA Content in the Extracted Lipids DHA 含量 / %氯仿∶甲醇 (v / v) 超声波提取法 酸热法 1∶2 12.34 ± 0.70 12.33 ± 0.97 1∶1 13.71 ± 0.49 13.52 ± 1.70 2∶114.53 ± 0.2913.95 ± 0.52ARA: 花生酸(内标), DPA: 二十二碳五烯酸, DHA: 二十二碳六烯酸图1 酸热法提取的裂殖壶菌油脂的气相色谱图Fig 1 Gas Chromatograph of the Lipids Extracted from Schizochytrium by Acid-heating Extraction24温州大学学报·自然科学版(2009)第30卷第6期 参考文献[1] Ward O P, Singh A. Omega-3/6 fatty acids: Alternative sources of production [J]. Proc Biochem, 2005, 40: 3627-3652.[2] 李植峰, 张玲, 沈晓京, 等. 四种真菌油脂提取方法的比较研究[J]. 微生物学通报, 2001, 28(6): 72-75.[3] 周茂洪, 周林, 赵肖为, 等. 1株裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的分离鉴定[J]. 微生物学通报, 2006, 33(4): 48-51.[4] Bowles R D, Hunt A E, Bremer G B, et al. Long-chain n-3 polyunsaturated fatty acid production by members ofthemarine protistan group the thraustochytrids: screening of isolates and optimization of docosahexaenoic acid production [J]. J Biotechnol, 1999, 70: 193-202.[5] 郑捷, 胡爱军. 超声对提取海藻二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的影响[J]. 声学技术, 2007, 26(1): 75-79.[6] Zhou L, Lu Y H, Zhou M H, et al. Enhanced Production of Docosahexaenoic Acid Using Schizochytrium sp. byOptimization of Medium Components [J]. J Chem Eng Jpn, 2007, 40: 1093-1100.Study on Methods of Lipid Extraction from SchizochytriumMA Jianshe1, HAN Fangfang1, YE Hairen2, ZHOU Maohong2,HUANG Kexin1, ZHAO Xiaowei2(1. Pharmacy School, Wenzhou Medical College; 2. College of Life and Environmental Sciences,Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)Abstract: Comparative studies among 3 different methods of lipid extraction from Schizochytrium (acid- heating, organic solvent and ultrasonic extraction) were carried out to evaluate their lipid extraction efficiency.The efficiency of acid-heating extraction or ultrasonic extraction was higher than that of the organic solvent extraction. The lipid extraction efficiency was highest when chloroform and methanol were mixed at the ratioof 1:1 (v/v). The content of DHA in the extracted lipids was highest when chloroform and methanol were mixed at the ratio of 2:1 (v/v). According to the experiments, the optimum lipids extraction efficiency can beachieved when chloroform and methanol are mixed at the ratio of 1:1 (v/v).Key words:Schizochytrium; Lipid; Acid-heating Extraction; Organic Solvent Extraction; Ultrasonic Extraction(编辑：王一芳)。