常明-江南大学-吐温对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响

本论文不同意在《中国食品学报》上发表吐温对裂殖壶菌发酵生产DHA的影响常明，李婧 ，李翔宇，刘睿杰，金青哲，王兴国*（食品科学与技术国家重点实验室食品，安全与营养协同创新中心，江南大学食品学院，无锡214122）摘要裂殖壶菌作为好氧型产油微生物，是目前工业化生产DHA的主要菌株之一。

吐温是一种表面活性剂，作为培养基添加物，可起到改变细胞膜渗透性、增强底物与氧气传质、促进生长、提高脂质积累的效果。

实验探究了吐温系列（tween-20、tween-40、tween-60和tween-80）对裂殖壶菌生长、脂质积累和脂肪酸组成的影响。

结果表明，在1%（v/v）添加量下，吐温20与40促进菌体生长；4种吐温均显著增强了菌体总脂积累能力，DHA产量分别比对照组提高了28.68%、29.33%、16.29%和20.67%；吐温20和40将最终总脂产量由22.68 g/L提升至29 g/L以上，DHA产量由10.74 g/L提升至约13.8 g/L。

关键词裂殖壶菌；吐温；发酵；DHAEffect of Tween on DHA production by Schizochytrium sp. SR21LI Jing, Chang Ming*, Li Xiangyu, Liu Ruijie, Jin Qingzhe, Wang Xingguo(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Synergetic Innovation Center Of Food Safety and Nutrition, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)Abstract Schizochytrium, one of the main sources of DHA, is aerobic oleaginous microorganism. Tween series, as non-ionic surfactants, added to the medium were known to interfere with the permeability of cell membranes, enhance the nutritional input and oxygen transfer, as well as improve growth and oil production of microorganisms. This research works were focus on the effect of Tween series (Tween-20, Tween-40, Tween-60 and Tween-80) on the growth, lipid accumulation and fatty acid composition in Schizochytrium sp. The results showed that total lipid content was significantly higher with Tween series (1%) and DHA yield were increased by 28.68%, 29.33%, 16.29% and 20.67% with Tween-20, Tween-40, Tween-60 and Tween-80 respectively. In addition, accompanying with the increasing of biomass, the total lipid and DHA production of Schizochytrium sp. were improved to 29 g/L and 13.8 g/L from 22.68 g/L and 10.74 g/L with 1% Tween 20 or Tween 40 respectively.Key words Schizochytrium; Tween; fermentation; DHA二十二碳六烯酸（22:6 n-3）（DHA）是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids），具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效[1]，近年来受到广泛关注。

微生物发酵法生产出的DHA避免了传统来源——深海鱼油存在的诸多问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高、含有EPA和胆固醇等[2]，具有广阔的应用前景。

裂殖壶菌（Schizochytrium）属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，是目前工业化生产DHA的热点菌株。

Schizochytrium藻油的安全性已得到美国FDA认可，2012年3月我国卫生部出台了《食品营养强基金项目：中国国家自然科学基金（31401619）；江苏省自然科学基金（BK20140156）作者简介：李婧（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物油脂*通讯作者：常明（1979-），男，副教授，研究方向为油脂生物技术化剂使用标准》GB14880—2012，批准Schizochytrium藻油DHA可用于婴幼儿配方食品。

吐温是山梨醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物（加成数为20），化学名称为聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯。

吐温系列包含有吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，分别为聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、单棕榈酸酯、单硬脂酸酯和单油酸酯。

吐温作为非离子型表面活性剂，亲水性强，广泛用作乳化剂和油类物质增溶剂等[3]。

研究表明，在发酵培养基中添加表面活性剂，可以改变微生物的生理学性质，提高代谢产物的合成，促进生长与呼吸，以及改变细胞膜结构和渗透性[4]。

Saenge等[5]发酵Rhodotorula glutinis生产脂质与类胡萝卜素时，在培养基中分别添加1%的吐温80、吐温20和阿拉伯树胶作为表面活性剂，结果显示三者都具有提高总脂含量的效果。

Taoka等[6]在基础培养基中添加1%的吐温80，也显著提高了破囊壶菌的生物量和总脂含量。

目前，吐温用于裂殖壶菌培养基添加物的研究未见报道。

本文研究了吐温系列（吐温20、吐温40、吐温60和吐温80）对裂殖壶菌生长、脂质积累和脂肪酸组成的影响。

在1%（v/v）添加量下，四种吐温对裂殖壶菌总脂产量和DHA产量均具有显著的提升作用。

本研究为利用表面活性剂提高Schizochytrium藻油生产效率提供了实验依据。

1 材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种裂殖壶菌Schizochytrium sp. SR21（A TCC1381），购自美国菌种收藏中心（ATCC）。

1.1.2培养条件培养基：①种子培养基（g/L）：甘油30、酵母膏5、谷氨酸钠5、Na2SO4 15、K2SO4 1、MgSO4·7H2O 3、K2HPO4 2、KH2PO4 3、VB1 0.005、VB6 0.002、VB12 0.005；②发酵培养基（g/L）：甘油100、酵母膏10、谷氨酸钠15、Na2SO4 15、K2SO4 1、MgSO4·7H2O 4、KH2PO4 0.1、VB1 0.008、VB6 0.002、VB12 0.015；pH6.5，维生素过滤除菌，其余121 ℃、20 min灭菌。

培养方法：①种子培养：250 mL三角瓶中装50 mL种子培养基，从斜面挑取菌落接入，25 ℃、200 r/min 摇床培养48 h；②发酵培养：250 mL三角瓶中装50 mL发酵培养基，10%（v/v）接种，25 ℃、200 r/min 摇床培养6 d。

1.1.3 主要试剂吐温20、吐温60、吐温80，国药集团化学试剂有限公司（上海）；吐温40，阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2实验仪器气相色谱仪，Agilent Technologies 7820A；ZWY-211B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；LDZX-50KB高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；ZHJH-C1112B超净台，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3发酵指标测定细胞干重、脂质提取参见文献[7]；脂肪酸甲酯化及气相色谱分析参见文献[8]。

每个实验重复3次，并用统计学方法求平均值。

2 结果与分析2.1吐温20添加量对裂殖壶菌发酵的影响2.1.1吐温20添加量对裂殖壶菌生长、总脂和DHA含量的影响以100 g/L 甘油为初始碳源，分别添加0%（对照）、0.1%、0.5%、1.0%（v/v ）的吐温20，25 ℃、200 r/min 发酵6 d 。

生长曲线见图1。

结果表明，甘油为碳源时，吐温20对裂殖壶菌的生长有一定促进作用，主要表现在发酵后期生物量的提高上，以添加量0.1%最为显著（41.50 g/L ），比对照组提高了5.16 g/L 。

甘油为碳源发酵时，随发酵后期菌体密度的增大，发酵液溶氧迅速下降，导致甘油初级代谢酶甘油激酶活力锐减，这是甘油作为碳源利用率较低的原因[9,10]。

吐温20作为乳化剂，有增强氧气传质的作用，可能在一定程度上改善了发酵后期溶氧不足的问题，从而提高了甘油利用率。

另一方面，吐温可以干扰细胞膜渗透性，提高细胞从外界吸收营养物质的能力；Taoka 等[11]曾将吐温80用于从海水中分离破囊壶菌，也是基于此原理。

从总脂含量与DHA 含量来看，如表1所示，吐温20对总脂积累有明显的提升效果，最终总脂含量与产量随添加量的增加而增大，以1%最为显著。

该效果主要表现在氮源耗尽之后（3 d ）。

吐温20对DHA 占总脂肪酸含量没有明显的影响。

但鉴于生物量与总脂含量的提高，DHA 产量分别比对照组提高了36.43%，35.41%和41.02%。

图1 吐温20添加量对生物量的影响Fig. 1 Effects of Tween-20 concentration on dry cell weight by Schizochytrium sp. SR21表1 吐温20添加量对总脂与DHA 含量及产量的影响Table 1 Effects of Tween-20 concentration on parameters in DHA fermentation by Schizochytrium sp. 吐温20/%总脂含量 /(%,细胞干重）总脂产量 /（g/L ） DHA 含量 /（%,总脂肪酸）DHA 产量 /（g/L ） 0 62.40 22.68 47.37 10.74 0.1 65.52 27.19 49.19 13.37 0.5 68.01 26.54 50.00 13.27 1.073.2729.0147.6413.822.1.2 吐温20添加量对裂殖壶菌脂肪酸组成的影响吐温20分子上连接有脂肪酸C 14:0。