大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群检验原始记录-平板计数法-2016版-5样
将以上VRBA平板倒置于36.0±1.°C,培养18h~24h（//时〜/_/时）并
分别计数可疑和典型菌落。
4.平板菌落数选择
选取菌落数在15~150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
5.证实试验（接种BG1.B）
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落，分别移种于BG1.B肉汤管内，36°C±1°C培养24h~48h,（//时〜/_/时）观察产气
大肠菌群检验原始记录（平板计数法）
检验单位
检验员
检验日期
至
环境条件
温度℃,相对湿度%
检验依据
GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》第二法
样品名称
产品批号
仪器设备及耗材：
电子天平、洁净工作台、电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、水浴锅、PH计、移液器
培养基及试剂：
结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（VRBA）：m1.配制日期：
第三稀释度
结果
CF∪∕m1.□CFU∕g□
VRBA疑似大肠菌群菌落数
接种BG1.B管数
BG1.B阳性管数
样品4
稀释度
第一稀释度
第二稀释度
第三稀释度
结果
CF∪∕m1.□CFU∕g□
VRBA疑似大肠菌群菌落数
接种BG1.B管数
BG1.B阳性管数
样品
5
稀释度
第一稀释度
第二稀释度
第三稀释度
结果
CFU∕m1.□CFU∕g□
2.接种VRBA
选择适宜的2~3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），吸取Im1.于无菌平皿内，每个稀释度接种两个平皿。同时分别吸取1m1.生理盐水加入两个无菌平皿内作为空白对照。及时将15~20m1.融化并恒温至46℃的VRBA倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，再加3~4m1.VRBA覆盖平板表层。同时再以只加VRBA的平皿，作为VRBA的空白对照。将平板翻转，培养。
大肠菌群检验中需注意的要点
大肠菌群检验中需注意的要点母永贵（米易县疾病预防控制中心；四川攀枝花617200）一、什么是大肠菌群？大肠菌群是指某些特性相同的细菌，并不代表某一个或者某一属细菌，主要是在需氧和兼性厌氧的情况下，可以分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群的分布较广，主要来源人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有污染肠道致病菌可能。
所以对于大肠菌群的检查是使用频繁的检查项目，只有在检查过程中通过对可以避免的操作或者结果进行分析和反复的检查，可以有效的提高大肠菌群的检出率，提高检查结果的有效性。
二、大肠菌群检验中需要注意的问题？大肠菌群的检查是临床中常见的实验室检查的一项常规内容，由于一些操作或者其他方面的影响很有可能导致检查结果的误差，从而出现检查结果的不准确。
所以在进行大肠菌群检验中一定要注意以下几个问题：（1）实验材料的选择：在对大肠菌群检查时，可选取糕点类或者肉类食品。
（2）抑菌剂的使用：通常在对大肠菌群检查时，对培养基中会加入一些抑菌剂，来抑制其他病原菌，但是抑菌剂中可能会对大肠菌群中的某些菌群起到轻微的抑制作用，从而导致检查结果的误差。
（3）稀释程度：由于要求对样本进行不同程度的稀释，但是很有可能因为稀释的程度而导致检测结果的偏差，从而降低检查结果的可靠性。
所以对于不同的样本在选择稀释程度时一定要选用最佳的稀释程度，避免结果的偏差。
（4）初步发酵：临床中对大肠菌群的定义是在37℃分解乳糖产酸产气，所以在初步发酵时，可以进行适当的延长培养时间，有助于大肠菌群细菌的复活和增殖，提高大肠菌群的检出率。
（5）挑选菌落：由于大肠菌群是一大类菌群的总称，在平板上呈现出不同的形态和特点，要选择典型的菌落进行检查，避免结果假阳性的出现，提高检出率。
（6）产酸产气情况：大肠杆菌可以分解乳糖产酸产气，往往在检测过程中着重于观察菌群发酵产气的情况。
由于不同的菌群其产气的能力不同，加上由于在筛选过程中，样本中所存留的大肠菌群数量的不足，很有可能在发酵初期，出现较小的气泡，但是大多数发酵管可以充满气体。
浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点
浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点摘要：本文介绍了食品中大肠菌群和菌落总数的检验中容易不规范操作的几个方面，并针对性地提出解决办法。
关键词：食品大肠菌群菌落总数检测规范前言目前，食品大肠菌群与菌落总数的检测标准主要是采用GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定[1]、GB4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[2]、GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[3]这三个国家标准。
但是目前国家标准只给出了实验的基本操作步骤及计算方法，而在实际的检验工作中，还存在一些影响操作可靠性的因素并未给出说明。
本文结合笔者自身检验经验，对大肠菌群与菌落总数的检测过程中易发生不规范操作的部分做出强调，以期对每个检验环节精确控制，以获得稳定可信的检验结果。
一、大肠菌群测定的一些要点：大肠菌群的发酵试验中要用到小倒管，主要用来观察气泡的出现。
但是实验中经常会出现还未接种样液，小倒管内就出现气泡，这样会影响结果的判断。
现列举出出现这种现象的几种原因及对策：1.小倒管的口太小。
在灭菌过程中，高压会将培养基压进小倒管，使空气排出，但如果小倒管开口过小，空气不容易出来，培养基也不容易进去，容易导致气泡残留在管内影响观察，若是这种情况，可以改用开口较大的V形管代替。
2.小倒管里面残留有水珠。
因为小倒管开口很小，清洗后内部的水不容易干燥完全。
这样会导致灭菌过程中培养基无法进去，使用时要注意放置小倒管前要将其内部的水甩干。
3.硅胶塞将试管口塞得过紧。
硅胶塞将试管口塞得过紧，会使在灭菌过程中试管内外的压力不一致，灭菌锅升温升压时，锅内压力大于试管内压力，压力不够将培养基完全压进小倒管，于是就会残留气泡。
塞子过紧还易导致灭菌锅降温时，锅内压力小于试管内压力，容易使试管内培养基喷出，培养基报废。
食品大肠菌群的测定(平板计数法)(精)
任务五 典型和可疑菌落计数
• 选择菌落数在15~150之间的平板，分别计 数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
• 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形 成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
• 任务六 证实试验
• 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进 行证实试验。
任务四 平板制备
选择适宜的稀释样液 根据对标本情况的估计,选择 3 个适宜稀释度,吸取该稀释度1mL稀释液于灭菌平皿内。
待培养基冷却至46℃左右，以无菌操作侵入无菌培 养皿中。每个平皿倒入约15-20mL培养基，利用培养基冲 散菌液，混匀。冷却凝固后，再在表面加3-4mL培养基。
从样品稀释到平板 涂布要求在15min 内 完成。
大肠菌群计数
1ml
1ml
1ml
生理 盐水
1:10
25g或
ml样品
1:100 1ml
1:1000 1ml
1:10000
1ml
1ml
VRBA的主要成分 乳糖、胆盐、结晶紫、 中性红及细菌生长所 必需的营养成分如:蛋 白胨、酵母膏等。 结晶紫和中性红为VRBA 的指示剂系统，在酸性条 件下为紫红色。
大肠菌群分解乳糖所 产生的酸与胆盐结合， 可形成沉淀。
加入46℃结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)培养基 12~15ml待琼脂凝固后，再加3-4mL培养基覆盖。
挑选菌落接种BGLB
典型菌落为紫红色 , 菌 落周围有红色的胆盐沉 淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。
实践操作
任务一 仪器试剂准备
任务二 仪器试剂灭菌
任务三 样品稀释制备
全过程遵循无菌操作程序，考虑如何满足要求？
食品微生物学检验 大肠菌群计数作业指导书
食品微生物学检验大肠菌群计数1、范围：适用于食品中大肠菌群的计数2、定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
3、设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。
3.2 冰箱：2℃~5℃。
3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
3.4 天平：感量0.1g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器3.7 无菌吸管：1ml、10ml或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。
3.9无菌培养皿：直径 90 mm。
3.10 pH计或pH比色管或pH试纸。
3.11菌落计数器。
4、培养基和试剂：4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤；4.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤；4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；4.4磷酸盐缓冲液；4.5无菌生理盐水；4.6无菌1moL/L NaoH；4.7 无菌1moL/L HCL。
第一法：大肠菌群 MPN计数法5、操作步骤：5.1样品的稀释固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。
样品均液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1moL/L NaoH或1moL/L HCL调节。
用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品均液。
大肠菌群平板计数法实验报告
大肠菌群平板计数法实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过大肠菌群平板计数法，检测两种不同类型的样品，分
别研究其大肠菌群的数量。
二、实验原理
大肠菌群平板计数法是一种测定复合微生物群落中不同细菌种群数量
的方法，通过在培养基上培养细菌分离特定细菌和其他微生物，然后在培
养基表面形成菌落，把形成的菌落数目统计出来就可以测定某一种细菌的
数量。
三、实验材料
1.无菌培养环：用于现场取样，主要成分是聚丙烯，尺寸为20
cm×40 cm；
2.筛选液：用于本实验的筛选液是根据微生物学原理，采用等量的乳
酸盐，氯化钠和磷酸盐等有机物质制备而成的液体，用于筛选出大肠菌群；
3.抗生素优势培养基：用于本实验，培养基由甘露醇、尿素、抗生素
等制备而成，用于培养出大肠菌群；
4.保存液：用于本实验的液体是根据微生物学原理，采用等量的乳酸盐、氯化钠和磷酸盐等有机物质制备而成，用于保存细菌；
5.透明细菌示踪液：用于本实验，示踪液由甘露醇、尿素、抗生素等
有机物质制备而成，用于追踪细菌的繁殖情况。
四、实验步骤
1.采样：用无菌环把样品和筛选液放在瓶中，搅拌均匀，然后加入适量。
大肠菌群检测中平板计数法主要操作要领
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
大肠菌群测定的质量控制
大肠菌群测定的质量控制l、实验室前阶段的质量控制操作者采样必须在无菌操作下进行。
送检应予以重视，放置过久，菌数将明显增加。
样品送到微生物检验室应越快越好。
如果路途遥远，可将不需冷冻的样品保持在l℃～5℃的环境中(如冰壶)。
如需保持冷冻状态，则需保存在泡沫塑料隔热箱内(箱内有干冰，可维持在0℃以下)。
总之，送检时间与检验开始时间之间越短越好，以减小人为误差。
2、仪器质控每天工作前、下班时应记录培养箱和冰箱的温度。
培养箱为36℃±1℃，冰箱2℃～8℃。
使用高压蒸气灭菌器时，应经常观察核对压力表与温度计在高压灭菌时是否与显示器一致。
为防止灭菌温度不够，可用化学及生物学质控指示物做监测指标。
3、培养基质控保存制备好的培养基应放冰箱(2℃～8℃)保存。
为了避免水分过快地丢失，应放在严密的有盖容器内或塑料袋内。
平板内培养基可保存两周左右，试管内培养基可保存l～2个月。
使用新批号培养基或自制的新培养基，必须用标准菌株进行核对，观察性能。
伊红美兰琼脂平板可用大肠埃希氏菌和福氏痢疾杆菌，菌液4×106倍稀释后接种，36℃培养24h，大肠杆菌生长，分解乳糖，菌落兰紫色。
福氏痢疾杆菌生长，不分解乳糖，菌落无色，半透明。
4、试剂的质量控制新配制的革兰氏染色液要记录配制时间。
配制后必须选用适当的标准菌株作阳性及阴性对照来鉴定性能。
经常使用的，要一周核对一次。
阳性对照可用金黄色葡萄球菌，阴性对照用大肠埃希氏菌。
应努力掌握染色技术及把握脱色时机。
遇到有些菌株革兰氏染色难以判断时，可用0．535 mol／L(3％)KOH试验加以区分。
方法：取0．535 mol ／L(3％)KOH溶液一小滴滴于玻片上。
用接种环取菌放其中研磨混匀，1 min能挑起粘丝者为革兰氏阴性菌，反之为革兰氏阳性菌。
5、检验程序的质量控制5.1所有检验均必须无菌操作，无菌室和超净工作台应紫外灯照射30min以上。
同时作空白对照接种环每次使用前后均应火焰彻底灭菌，但接种时一定要注意冷却，否则本应检出的样品可能出现未检出的报告。
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大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要
求检测的项目。
在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠
菌群平板计数法的注意事项。
方法选择
相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。
但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。
但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。
假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。
若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标
此处不再赘述。
因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。
培养基的要求
平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。
无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。
特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。
大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。
当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。
另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。
但值得注意
的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。
稀释度的确定
国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。
什么样的稀释度是合适的呢这要根据计数来决定。
计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，
因此培养后菌落数在这个范围内的稀释度就是适宜的稀释度。
实验室经常检测的
产品的大肠菌群的水平检测人员可以预计的，但是对盲样，我们能做的只有根据实际情况多检测几个稀释度了。
这里需要提一句，液体样品的检测稀释度可以包
括原液。
证实试验
需要从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部的典型和可疑菌落进行BGLB肉汤管验证。
这里挑取的菌落也是应当有选择的，典型菌落和可疑菌落的比例应当与平板上培养的两种菌落的比例相同
或相近，这样能够降低检测过程中的误差。
计数的报告
报告过程是很多朋友存在疑问的地方，因为平板计数法的结果报告需要结合培养基菌落数和复发酵验证两方面进行计算。
存在疑问的情况主要有以下几种：
1.所有稀释度都不在计数范围内怎么办这种情况一般都是最低稀释度的平板
都小于15CFU，这种情况就是以最低稀释度的平板菌落数乘以验证试验的比例来计算。
例如10倍稀释的两个平板上菌落数分别为10、8，菌落数为10的平皿挑取10个菌落复发酵中有8个菌落产气，菌落数为8的平皿挑取8个菌落复发酵中有7个菌落产气，则计算过程是这样的：(10*8/10+8*7/8)/2*10=75CFU/g（mL）。
2.连续两个稀释度的四个平皿的菌落数都在计数范围内怎么办这个需要参考
菌落总数检测国标里里的公式计算。
我们需要先计算每个平皿的验证后的菌落数，再代入公式计算即可。
例如10倍稀释度两个平皿菌落数为120和125,100倍稀释度两个平皿的菌落数为17和16，经过复发酵验证产气的管数分别为7、8、8、8，则我们先计算每个平皿上的菌落数分别为
120*7/10=84,125*8/10=100,17*8/10=（我们计14），16*8/10=（我们计13），然后将84、100、14、13四个数代入公式：（84+100+14+13）/（2+）*10=959，结果应报告960CFU/g（mL）。
3.只有一个稀释度的一个平皿的菌落数在计数范围，其他均不在计数范围怎
么办这样我们只需要复发酵验证这一个平皿即可，根据这一个平皿的菌落数进行报告。
例如10倍稀释度两个平皿菌落数为160和142,100倍稀释度两个平皿的菌落数为12和13，则我们只需要从菌落数为142CFU的平皿里挑取10个菌落进行复发酵验证即可，假如共有7支发酵管阳性，则应计算142*7/10=，结果报告99CFU/g（mL）。
其实只要是平板菌落计数的相关问题，我们都应按照GB 里要求的结果与报告要求进行计算和报告即可，无论那种情况，都是万变不离其宗的。