(整理)限制酶应用
限制性内切酶使用
限制性内切酶的使用一个标准的酶切反应包含：1、DNA2、合适的酶缓冲液3、蛋白酶4、为了提高酶切效率，可加入BSA。
3、加酶应用中的注意点内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
4、DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素5、缓冲液对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。
使用时的缓冲液浓度应为1X。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
不需要BSA 的酶如果加了BSA也不会受太大影响6、反应体积内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg 的底物DNA所需的酶为一个活力单位。
因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。
较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。
为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）7、混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。
想要反应完全，必须使反应液充分混合。
我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。
注意：不可振荡！8、反应温度大部分酶的反应温度为37℃；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。
一般为50-65℃不等9、反应时间1酶活单位的定义时间为1小时。
如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全10、终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。
我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。
如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65℃或85℃，20分钟）。
热失活并不能适用于所有的酶。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
限制酶的特性和作用
） 。Ａ ．０ ．
高营养级 生物获 能的最 大（ 最 小） 值 的计 算
人可 以获得最大能量是— — 。
例题 ： 上
述 图 ３所示的食 物 网中 ， 若水 藻 的能量值 是 １ Ｏ ｋ ， ｌ ， 则 解析 ： 人要想获得最大能量值 ， 则应选 择人所 在的
方法规律 ： 已知低营养级 的能量值 ， 求高 营养级获
得 的最大 （ 最小 ） 能量值 ， 应 该选取 高营养 级的 生物所
酶 。这类酶能够识 别双链 Ｄ Ｎ Ａ分子 的某 种特 定核 苷
响重组 载体的形成。 如果用两 种 不 同限制 酶 同时 切割 （ 双 酶切 ） 形 成
酸序列 ， 并且使每一 条链 中特定 部位 的两个 核苷酸 之
间 的磷酸二酯键断开。 １ 限制酶的专一性
的 目的基因 、 运载体 ， 不但 可 以连 接起来 ， 而且 一 般情 况下效果 更好 ， 因为这样可以避免 目的基 因、 运 载体 的
育出版社 ， ４ ５ ８—４ ５ ９ ０
量传递效 率为 １ ／ ８ ０ ０×１ ０ ０ ％＝ ０ ． １ ２ ５ ％。 ４ ． ４ 已知较低 营养级的能量 （ 生物量） 值， 但 未知传递
效率和能量传给 下一 营养级 不 同生物 的分 配比例 ， 求
么， 绿色植物到鹰 的能量 传递 效率 为 （
转化为鹰 的食 物链 中各 营养 级 的生 物 量。 即： ｌ ｋ ｇ的
鹰需要小鸟 的生物量 １ ０ ｋ ｇ ， １ ０ ｋ ｇ的小 鸟需 要 昆虫的生 物量 ＝１ ０÷（ ０ ． ５÷ ４ ） ＝８ ０ ｋ ｇ ； ８ ０ ｋ ｇ 的 昆虫需 要绿 色植 物 的生物量 ＝８ ０÷（ １ ０÷１ ０ ０ ） ＝８ ０ ０ ｋ ｇ 。 因此 ， 从绿色植物一 昆虫一小 鸟一 鹰 的生物 量依 次为 ８ ｏ ０ ｋ ｇ 一８ ０ ｋ ｇ 一１ ０ ｋ ｇ 一１ ｋ ｇ ， 则 绿 色植 物 到鹰 的能
限制酶的作用
限制酶的作用限制酶（restrictive enzyme）是一类能够识别特定的DNA序列并在该序列的特定位点上剪切DNA分子的酶。
限制酶在生物学研究中有着重要的应用，包括DNA重组、基因工程以及分子生物学实验等领域。
限制酶的作用机制主要涉及两个方面：识别特定的DNA序列以及剪切DNA分子。
限制酶一般通过“酶-底物”互作来进行DNA序列的识别。
每一种限制酶都有一段特定的DNA序列（也称为限制酶切割位点），只有当DNA序列与该切割位点完全匹配时，限制酶才能结合到DNA上。
一旦限制酶与DNA序列结合，酶就会剪切DNA分子，产生两个断裂的末端。
限制酶的作用被广泛应用于DNA重组研究中。
通过使用不同的限制酶，研究人员可以精确地剪切DNA分子，并将不同源的DNA片段连接在一起，从而构建出具有特定功能的重组DNA分子。
这种技术不仅在基因工程研究中起到了关键的作用，也被广泛应用于制造转基因生物、病毒载体构建以及人工合成DNA等领域。
此外，限制酶还被用于DNA测序和DNA分析等实验中。
通过对DNA分子进行限制酶切割，可以得到一系列的DNA片段。
这些DNA片段可以被进一步用于测序、聚合酶链反应（PCR）扩增以及凝胶电泳等实验中，以实现对DNA序列和结构的研究。
在基因组学研究中，限制酶也被用于DNA指纹图谱的构建。
DNA指纹图谱通过限制酶切割不同个体的DNA样本，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，最终形成特定的DNA条带图谱。
这种技术被广泛应用于物种鉴定、犯罪侦查、亲子鉴定以及种质资源保护等领域。
然而，限制酶也存在一定的局限性。
首先，限制酶需要在特定的温度和离子浓度条件下才能发挥作用，因此在实验操作过程中需要严格控制条件。
此外，限制酶只能识别特定的DNA序列，它对于DNA序列中的变异或突变无法识别。
因此，在某些情况下，研究人员需要使用多个限制酶来进行验证和确认。
综上所述，限制酶作为一种重要的生物学工具，在DNA重组、基因工程以及分子生物学研究中起到了至关重要的作用。
限制酶使用说明
限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。
因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。
二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。
被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。
另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。
2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。
并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
限制酶使用说明
■ 保存
开封后室温保存。
Double Digestion(双酶切反应)时 Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表
■ 说明 使用二种酶同时进行 DNA 切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。TaKaRa 采用 Universal Buffer 表示系统，并对每种酶表示了在各 Universal Buffer 中的相对活性。尽管如此，在进行 Double Digestion 时，有时还 会难以找到合适的 Universal Buffer。 本表以在 pUC 系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在 Double Digestion 可使用的最佳 Universal Buffer 条件。在本表 中，各 Universal Buffer 之前表示的 [数字×] 是指各 Universal Buffer 的反应体系中的最终浓度。TaKaRa 销售产品中添附的 Universal Buffer 全为10倍浓度的缓冲液。终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。 ■ 注意 ◇ 1 μg DNA 中添加10 U 的限制酶，在50 μl 的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解 DNA。 ◇ 为防止 Star 活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。 ◇ 根据 DNA 的种类，各 DNA 的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生 Double Digestion 不能顺利进行的可 能。
泳图谱，判断酶中是否夹杂有非特异性核酸酶。 2. 基因组 DNA 分析
对指定的限制酶(在酶的分项介绍中标明)进行该项检测。在适当的细菌 DNA 底物中 (琼脂糖凝胶块 中的 DNA 浓度为0.5 μg/50 μl)加入20～150 U 的限制酶，反应24小时，然后进行琼脂糖电泳，根据电泳 图谱，确认酶中是否含有杂质。 3. 连接—再切检定
高中生物限制酶知识点
高中生物：限制酶知识点限制酶是一种在分子生物学领域中广泛使用的工具，它在DNA分析和基因工程中起着重要的作用。
本文将介绍限制酶的定义、作用机制、分类以及在实验室中的应用。
一、定义限制酶，又称为切割酶，是一类能够识别特定DNA序列并将其切割为特定片段的酶。
它们是一类天然存在于细菌和古菌中的酶，用于保护细菌免受入侵的外源DNA（例如噬菌体）的攻击。
二、作用机制限制酶通过识别特定的DNA序列，称为限制性核酸位点（restriction sites），并在该位点上切割DNA链。
限制酶能够识别的核酸位点通常是对称的，例如5’ - GAATTC - 3’和3’ - CTTAAG - 5’，它们在正反两条链上具有相同的序列。
当限制酶识别到这样的位点时，它会切割DNA链，产生两个断裂的DNA链。
三、分类根据限制酶的作用机制和识别位点的序列，限制酶可以分为不同的类别。
常见的限制酶有： 1. I型限制酶：这类限制酶能够识别DNA序列，但切割位点并不紧邻其识别位点。
它们通常需要辅助蛋白质的帮助来完成切割作用。
2. II型限制酶：这类限制酶能够直接识别并切割DNA链。
它们识别的核酸位点通常是对称的，并且切割位点在限制性核酸位点的附近。
II型限制酶是最为常见和广泛应用的限制酶。
3. III型限制酶：这类限制酶与I型限制酶类似，也需要辅助蛋白质来完成切割作用。
它们与I型限制酶的主要区别在于，识别位点和切割位点之间存在一定的距离。
四、实验室应用限制酶在实验室中被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
以下是一些常见的应用： 1. DNA切割：限制酶可以用于将DNA切割为特定的片段。
通过使用不同的限制酶组合，可以得到不同长度的DNA片段，用于DNA分析和构建基因库等。
2. DNA连接：限制酶也可以用于将不同的DNA片段连接起来。
通过选择适当的限制酶和连接酶，可以将不同的DNA片段组装成目标序列。
3. DNA标记：有些限制酶能够在切割DNA链的同时，在切割位点的末端引入特定的序列（例如蛋白质识别位点或荧光标记）。
限制性内切酶技术在基因工程中的应用
限制性内切酶技术在基因工程中的应用基因工程作为生命科学领域的前沿技术之一，已经成为了当今世界农业生产、医疗保健、环境保护等领域中不可或缺的一部分。
在这个过程中，限制性内切酶技术发挥的作用十分重要，因为它可以方便地对DNA分子中的目标序列进行选择性切割，从而实现基因工程技术的多种应用。
这里，我们主要论述限制性内切酶技术在基因工程中的应用。
一、限制性内切酶技术的概述限制性内切酶是细菌体内存在的一种具有特定特性的内切酶，在酶学中有一个很长的历史。
它们最先在20世纪50年代被发现，随后又在60年代得到了更广泛的应用。
这种酶可以在DNA分子中寻找到一段特定的核苷酸序列，并在该序列外侧切割骨架中的化学键。
不同的限制性内切酶有着不同的底物特异性和识别序列。
有些酶只认可具有对称性的序列，在DNA双链中的两个链也同时被切割，如EcoRI，而另一些酶则只切割特定的非对称的序列，如HpaII。
二、限制性内切酶技术的原理限制性内切酶技术的原理非常简单，利用细菌或者微生物体内产生的限制性内切酶靶向切割特定的DNA序列。
首先，需要将待切割的DNA序列和所需的限制性内切酶混合，然后在合适的反应条件下，产生酶促的DNA切割。
一般情况下，DNA序列和限制性内切酶在混合后会在较短的时间内结合。
最终，在适当的反应条件下，在目标DNA序列内，适当地刺激酶作用，就可以实现目标DNA序列的切割。
切割后的DNA分子可用于克隆、测序、PCR等一些基本的操作。
三、限制性内切酶技术在基因工程中应用非常广泛，主要包括以下几个方面。
1.基因克隆基因克隆是指把DNA片段插入到另一个DNA分子中的操作。
限制性内切酶可用于扩大DNA片段，甚至特定的目标序列，以便于克隆。
通过选择合适的限制性内切酶，将其切割需要被插入的DNA和载体DNA，就可以生成相应的克隆载体。
选择合适的限制性内切酶也可以帮助确认目标DNA的长度和结构，从而避免一些问题的出现。
2.PCR聚合酶链式反应（PCR）技术是基因工程实验中应用最为广泛的技术之一。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
限制酶作为酶类，决定其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。
其中专一性的具体表现为：某种限制酶只能催化DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键水解，结果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。
限制酶所识别的双链DNA上的序列具有“回文对称”性质，即无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，即错位平切，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，即平切，产生平末端。
错位切的限制酶在基因工程中最常使用，因为与平末端相比较，黏性末端更有利于DNA片段的连接。
例1下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端）：限制酶1：——↓GATC——；限制酶2：——CATG↓——；限制酶3：——G↓GATCC——；限制酶4：——CCGC↓GG——；限制酶5：——↓CCAGG——。
请指出下列哪组表达正确（）
A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对
B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对
C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同
D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同
解析：限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。
限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。
限制酶1剪出的黏性末端是：—C T A G，限制酶2剪出的黏性末端是：—C A T G，限制酶3切割产生的黏性末端是:—C T A G，故D错。
答案 C。