高效液相色谱法优秀课件
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高效液相色谱法hPPT课件
❖ 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理 论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、 操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱 法优越性，现从两方面进行比较：
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。
❖ 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测器 的有示差折光，电导检测器等。
第三节 固定相和流动相
（－）固定相
❖ 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
❖ 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～ 1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的 颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合 固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种 固定相。
1、高压输液系统
❖ 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。
❖ 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。
❖ 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
❖ 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
1.表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔 活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、 聚酸胺等。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动 相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不 稳，或产生“伪峰”。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。
❖ 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测器 的有示差折光，电导检测器等。
第三节 固定相和流动相
（－）固定相
❖ 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。
❖ 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～ 1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的 颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合 固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种 固定相。
1、高压输液系统
❖ 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。
❖ 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。
❖ 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
❖ 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔 型和全多孔型固定相两类。
1.表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔 活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、 聚酸胺等。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动 相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不 稳，或产生“伪峰”。
液相色谱法ppt课件
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
waters-e2695高效液相色谱 ppt课件
在浏览项目中，点“通道”→双击要处理的原始数据（点查看图标） →进入查看主窗口→提取色谱图→点“处理方法向导”图标→新建 处理方法→峰1、峰2→积分区域（选定要积分的峰）→给出条件剔 除不要的峰→→→……→纯度匹配→PDA光谱对照→处理方法名→ 完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出）→点“方法组”图
精选ppt课件色谱的基本流程图色谱的基本流程图流动相色谱柱检测器泵输液分离检测记录精选ppt课件精选ppt课件精选ppt课件waterse2695分离单元2498型紫外检测器打印机四元梯度洗脱的溶剂输送系统四通道在线真空脱气机可容纳120个样品瓶的自动进样系统内置的柱塞杆密封垫清洗系统溶剂瓶托盘液晶显示器键盘用户界面及软盘驱动器精选ppt课件10打开电源至on位置开机依次接通2695分离单元检测器计算机和打印机的电源
比如表头，色谱图的显示范围，表格中所需内容等。
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关机
数据采集完毕后，关闭检测器电源开关，以节省使用寿命。 使用完毕，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样
器、进样针和柱塞杆密封垫，确保 2695 分离单元已彻底冲洗干净
后，关闭电源开关。
谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱 带宽度增加的现象
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色谱图 参数基本概念
死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间
保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
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高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，
来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最 佳平均k值通过色谱柱。
它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的
程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变
化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的， 而不是借改变温度（温度程序）来达到。
梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一 定的比例抽入高压泵 中混合。
第三节 分配色谱 （Partition Chromatography）
根据分离机理的不同，高效液相色谱法主要可 分为分配色谱、液固吸附色谱、离子交换和离子色 谱、空间排阻色谱等。其中，最常用的是分配色谱 法。一般将其分为液液色谱和键合相色谱.
HPLC与GC差别
气相色谱
高效液相色谱
只能分析挥发性物质，只能分析20%的化 合物 不能用于热不稳定物质的分析 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用 检测器（FID和TCD） 流动相为气体、无毒、易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小
几乎可以分析各种物质
可以用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高 压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、 压力脉动阻力器等组成。
（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在 1~2%左右；
（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10 mL min-1之间，制备型仪器能达到100 mL min-1；
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
第一节 液相色谱柱效
速率理论（与GC对比）
1. GC：HAB/uCu （填充柱）
或 H B/u Cu （毛细管柱）
A2dp
A dp
B2D m2Dg BtR， BDg
流动相有毒、费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
光电二极管阵列检测器
（2）总体检测器 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属 于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。
5、附属系统
包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收 集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压 液相色谱仪中尤为重要的附属装置。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相 应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目 的。
柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽， 主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死 体积。
柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引 起往前展宽的主要因素。
3、分离系统——色谱柱
色谱柱包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑 的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金 属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝 胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可 达25 mm 以上。
Dg T或Dg
T M
C C mC sC gC l C l
Cl
df 2 Dl
DL
T
2. H P L C ： H A C u
B2Dm
Dm
T
柱T温 低，流 大 动 B 相 相忽略
➢ 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响
u1cm /s时H ， u u H， n 柱 效 ，tR 但
兼顾柱效和分选 析择 时 u1间 ml/， min
dp 2 C
Dm
Dm
T
d p C H， n 柱 效
D m H ， n柱 效
TDm C，但易产生气泡
TDm ，，柱阻
第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进 样及数据处理等。
当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流 动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送 出的信号记录下来，得到液相色谱图。
（3）输出压力高、密封性好，要求最高压 力300~500 kg/cm2；
（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水 和缓冲溶液；
（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维 修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。
高压泵工作原理.swf
2．进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒 度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装 柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下， 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗 后，即可备用。
4．检测系统
（1）溶质性检测器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属 于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。
2）涡流扩散项及其影响
A2dp
A dp
， d p A H ， n柱 效
3）传质阻力项及其影响
CCmCsmCs CmCs（ m 忽略固定相 ）传 注：只考虑流动相态 和流 静动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
H P L C ： H A C m u C s m u
Cm
Csm
dp2 Dm
高效液相色谱法优秀课件
高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的 固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种 液相色谱法。
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
高效液相色谱
常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高压，40～50Mpa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高，40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测