膜片钳技术数据处理与分析 ppt课件
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膜片钳技术数据处理与分析课件
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
信号采集后的滤波
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit滤波类型
Lowpass
Patch clamp training class
PPTA学p习r. 2交3-流25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
坏点的赋值 （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的数值。 （2）Mean between cursor 1..2：Cursor 1-2之间均值。 （3）Mean between cursor 3..4：Cursor 3-4之间均值。 （4）Straight -line fit between cursor 1..2：Cursor 1-2之间的直线拟合
Patch clamp training class
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示基线调零方法
Patch clamp training class
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膜片钳实验数据的处理
二、坏点的去除
坏点产生的原因 ➢ 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。 ➢ 电容瞬变电流：电容的充放电反应。 ➢ 瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时） ➢ 手机来电：一过性高频。 ➢人手靠近记录探头：高幅、高频。
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膜片钳实验数据的处理
浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
EI所需最少数据点的计算举例 滤波器所需最少数据点＝ （采样频率/ 50 Hz）× Cycles to average 若采样频率＝ 10 kHz， 则一个50 Hz正弦波周期的采样点数＝ 10 kHz / 50 ＝200 点 若设定Cycles to average ＝ 10，则需要的最少采样点数＝ 2,000点
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膜片钳实验数据的处理
Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示 在该框底部。 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前 后一些数据点（取决于Smoothing points，取3-99中的奇数） 的平均值赋予当前数据点，完成滤波。 Smoothing points值越大，数据幅度削减越大。 （3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均 值中所占的比例较大。 （4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。 （5）RC ( single-pole)：用于时域数据。 （6）8-pole Butterworth：用于频域数据。 （7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。
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膜片钳实验数据的处理
一、基线的调零
二、坏点的去除
三、滤波 四、数据文件内部/之间的数学运算
Patch clamp training class
膜片钳技术讲座幻灯
1. 膜片钳技术简介
1976 年 德 国 马 普 生 物 物 理 化 学 研 究 所 Neher 和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电 位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh） 激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术 （patch clamp techniques）。 1980 年 Sigworth 等 获 得 10-100GΩ 的 高 阻 封 接 （Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术 进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该 技 术 更 趋 完 善 ， 1983 年 10 月 ， 《Single-Channel Recording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里 程碑。
内向电流（Inward current） 从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+ ）电流或从
细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。
外向电流（Outward current）
从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细
胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。
3. 膜片钳系统中的电阻
膜电阻（Membrane resistance, Rm） 指脂质双分子层的跨膜电阻，反映离子是否容易 穿透细胞膜。在细胞膜离子通道关闭时， Rm很大， 可达几百MΩ。不同于膜电容， 各种细胞的Rm 变异 较大。 膜输入阻抗（Membrane input resistance, Rin） 对 Rm 的测量是通过对膜输入阻抗的测量间接得到 的。给细胞膜施加一系列刺激方波，测定跨膜电流， 根据欧姆定律即可求出Rin 。注意要在形成全细胞记 录时测定，在形成高阻封接时， Rin =Rseal。
膜片钳patch-clampppt课件
钠通道的分类 根据对钠通道阻滞剂TTX和µconotoxin (µCTX)的敏感性不同分为3类： （1）神经类钠通道：对TTX敏感性高，而对µCTX敏感 性低。 （2）骨骼肌类钠通道：对TTX和µCTX敏感性均高。 （3）心肌类钠通道：对TTX和µCTX敏感性均低。
心肌钠通道，激活所需要的电压高、失活速度快、 引起动作电位（action potential, AP）的0期去极化 。
三、离子通道的分子结构及门控机制
1．电压门控离子通道的分子结构 钠、钙和钾电压门控通道在分子结构上有许多相似之处，离
子通道蛋白是多亚基（subunits）构成的复合体。其中，构成孔道部 分的是α亚基。各种电压依赖的离子通道的α亚基均在膜上形成四个 跨膜区（D1-D4）,钠、钙通道的四个跨膜区由共价键连接成四倍体 位于同一肽链，整个亚基只有一个N-末端和一个C-末端。钾通道的 α亚基只有一个跨膜区，功能性钾通道是四个α亚基由非共价键连接 而成的四聚体。每个跨膜区由6个呈α螺旋式的跨膜片段 （transmembrane segmants, S1-S6）及其间的连结肽链所组成。连接 S5-S6的肽链部分贯穿于膜内，是形成亲水性孔道而有选择性地让离 子通过的部分，称为孔道区（pore region）或P区。另一个重要的肽 段是S4 , S4共带4～8个正电荷，当膜电位变化时，S4螺旋构型即发 生变化，通道开放，故S4被称为电压门控性离子通道的电压感受器 （voltage sensor）。
2．内向整流钾通道的分子结构
具有内向整流性钾通道，主要指KIR，KACh， KATP等，他们与Kv通道一样由4个α亚单位对称 排列而成，但每个α亚单位只有2个跨膜螺旋片 段（M1和M2），两者由H5连接。
3.离子通道的门控机制
电压依赖性钠通道受膜电位的影响，在 不同电压影响下，通道蛋白发生构象变 化而使通道不断转换于静息态（resting state）、开放状态（open state）和失活 状态（inactive state）。
心肌钠通道，激活所需要的电压高、失活速度快、 引起动作电位（action potential, AP）的0期去极化 。
三、离子通道的分子结构及门控机制
1．电压门控离子通道的分子结构 钠、钙和钾电压门控通道在分子结构上有许多相似之处，离
子通道蛋白是多亚基（subunits）构成的复合体。其中，构成孔道部 分的是α亚基。各种电压依赖的离子通道的α亚基均在膜上形成四个 跨膜区（D1-D4）,钠、钙通道的四个跨膜区由共价键连接成四倍体 位于同一肽链，整个亚基只有一个N-末端和一个C-末端。钾通道的 α亚基只有一个跨膜区，功能性钾通道是四个α亚基由非共价键连接 而成的四聚体。每个跨膜区由6个呈α螺旋式的跨膜片段 （transmembrane segmants, S1-S6）及其间的连结肽链所组成。连接 S5-S6的肽链部分贯穿于膜内，是形成亲水性孔道而有选择性地让离 子通过的部分，称为孔道区（pore region）或P区。另一个重要的肽 段是S4 , S4共带4～8个正电荷，当膜电位变化时，S4螺旋构型即发 生变化，通道开放，故S4被称为电压门控性离子通道的电压感受器 （voltage sensor）。
2．内向整流钾通道的分子结构
具有内向整流性钾通道，主要指KIR，KACh， KATP等，他们与Kv通道一样由4个α亚单位对称 排列而成，但每个α亚单位只有2个跨膜螺旋片 段（M1和M2），两者由H5连接。
3.离子通道的门控机制
电压依赖性钠通道受膜电位的影响，在 不同电压影响下，通道蛋白发生构象变 化而使通道不断转换于静息态（resting state）、开放状态（open state）和失活 状态（inactive state）。
膜片钳原理PPT课件
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膜片钳的放大器
膜片钳放大器是膜片钳技术的核心仪器，放大器主 要有差分放大器、频率提升部分、加法器、瞬时补偿和 钳位放大器等部件组成。放大器的核心部分是差分放大 器，此差分放大器是一电流-电压转换器，可将记录到的 电流以电位差的形式输出。到目前为止放大器的发展已 经经历了三代的发展过程。目前普遍应用的膜片钳放大 器有德国HEKA公司的EPC系列(最新的产品是EPC-9)和 美国Axon公司生产的Axon Patch 系列(最新产品是Axon200B)，日本NIHONKOHDEN公司的CEZ系列。国产放 大器有华中理共大学的PC-Ⅰ和 PC-Ⅱ系列(最新的产品 是PC-ⅡB)，上海生理所的IP-Ⅰ型等。
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电极内液可更换为药物或毒素等非生理 性成分，研究药物对电压依赖性通道的影响， 从而对通道开关动力学的作用达到从微观水 平上研究药物作用的功能机制。也可任意改 变膜片内外液的浓度组分，研究各组分对膜 通 透 性 的 影 响 ， 值 得 注 意 的 是 H+ 、 Ca2+ 浓 度要适宜。也可用相应的激动剂作用于膜受 体，在监测离子通道电流流动过程中，了解 经G蛋白介导的第二信使作用，研究跨膜信 息转导的途径。
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膜片钳技术的原理
膜片钳技术是用微管电极接触细胞膜，以千兆欧 姆（gigaohm seal GΩ）以上的阻抗使之封接，使于电 极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片patch）与其 周围在电学学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜 片上的离子通道的离子电流（pA级最小可达0.06pA） 进行检测记录的方法。
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膜片钳的四种工作模式
1.细胞贴附式（cell-attached） 2.全细胞模式（whole -cell recording） 3.内面向外式（inside-out） 4.外面向外式（outside-out）
膜片钳技术原理及相关基本知识ppt课件
冲动，最终形成嗅觉或味觉。
• 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后
者仅发现于内皮细胞和心肌细胞
• 水通道
2003年诺贝尔化学奖：
Pete Agre、 Roderick MacKinnon
失活 状态
Inactive
state
复活
recovery 静息 状态
resting state
二、门控特性(Gating)：
失活状态不仅是通道处于关闭状态， 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
失活
inactivation
开放 状态
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History of Ion Channel Study
• 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage
clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现， 放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞 的运动，并提出了“通道”的概念。
• 1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模
善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（
膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
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• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了
终板电位；1969年，又证实N－M接触后的Ach 以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。
• 1976年 ，德国 的Neher 和Sakmann 发明Patch
激活
activation
open state
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膜片钳PPT课件
2021
（二） 受体:细胞膜或细胞内能与某些化学物质(递质、调质、激素) 特
异性结合并产生生物效应的特殊分子。细胞膜上涉及到离子通道的主要受体：
Glu能离子型受体
激动剂
拮抗剂
AMPA
GluR1 Glu
CNQX
GluR2 AMPA
GluR3
GluR4
Kainate
GluR5 Glu
CNQX
GluR6 KA
• 配制切片液及灌流液ACSF，冻存切片液至冰水混合态 • 二元气饱和ACSF • 动物麻醉、断头、取脑、切片 • ACSF中孵育脑片至少30min • 拉制玻璃电极 • 脑片入记录槽，持续ACSF灌流1-3ml/min • 低倍镜定位，IR-DIC镜选择靶细胞
2021
23
• 玻璃微电极充灌电极内液(预配)，并固定于电极夹持器 • 维持电极正压，入液，补偿液接电位 • 操纵电极尖端至靶细胞上方，压之有凹痕（快） • 撤正压，予负压，予半量钳制电压，GΩ（1min 内）封接
1. 结构研究：生化确定蛋白质氨基酸序列+X线衍 射确定结构+……
2.功能研究：电生理技术（膜片钳） +……
3.结构和功能相结合：电生理技术（膜片钳） +转 基因技术+……
2021
3
电流钳----测电压
向细胞内注入恒定或变化的电流，记录相应膜电位变化
电压钳----测电流
为负反馈系统。注入电流，同时钳制电压于固定的某值，此时注入电流恰 好与离子通道开放产生的离子流大小相等，方向相反，以此得知该离子流大 小及方向。
后予全量钳制电压
• 补偿C-fast，破膜 • 补偿C-slow，稳定10-15min
（二） 受体:细胞膜或细胞内能与某些化学物质(递质、调质、激素) 特
异性结合并产生生物效应的特殊分子。细胞膜上涉及到离子通道的主要受体：
Glu能离子型受体
激动剂
拮抗剂
AMPA
GluR1 Glu
CNQX
GluR2 AMPA
GluR3
GluR4
Kainate
GluR5 Glu
CNQX
GluR6 KA
• 配制切片液及灌流液ACSF，冻存切片液至冰水混合态 • 二元气饱和ACSF • 动物麻醉、断头、取脑、切片 • ACSF中孵育脑片至少30min • 拉制玻璃电极 • 脑片入记录槽，持续ACSF灌流1-3ml/min • 低倍镜定位，IR-DIC镜选择靶细胞
2021
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• 玻璃微电极充灌电极内液(预配)，并固定于电极夹持器 • 维持电极正压，入液，补偿液接电位 • 操纵电极尖端至靶细胞上方，压之有凹痕（快） • 撤正压，予负压，予半量钳制电压，GΩ（1min 内）封接
1. 结构研究：生化确定蛋白质氨基酸序列+X线衍 射确定结构+……
2.功能研究：电生理技术（膜片钳） +……
3.结构和功能相结合：电生理技术（膜片钳） +转 基因技术+……
2021
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电流钳----测电压
向细胞内注入恒定或变化的电流，记录相应膜电位变化
电压钳----测电流
为负反馈系统。注入电流，同时钳制电压于固定的某值，此时注入电流恰 好与离子通道开放产生的离子流大小相等，方向相反，以此得知该离子流大 小及方向。
后予全量钳制电压
• 补偿C-fast，破膜 • 补偿C-slow，稳定10-15min
细胞电生理学与膜片钳技术ppt课件
CCD Camera
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Electrophysiology-Apparatus
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
钠通道 钙通道 钾通道
神经类钠通道 骨骼肌类钠通道 心肌类钠通道(持久、瞬时)
L-型（心肌窦房结、房室结）；T-型（心脏传 导组织）；N-型（中枢神经系统神经元和突 触部位）；P-型（大脑）；Q-型（小脑、海 马、脊髓）；R-型（神经细胞）
瞬时外向钾通道 (Ito) 延迟整流钾通f)
失活 状态
Inactive
state
复活
recovery 静息 状态
resting state
二、门控特性(Gating)：
失活状态不仅是通道处于关闭状态， 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
失活
inactivation
开放 状态
心血管系统主要有: 1.乙酰胆碱激活钾通道(KACh)：参与迷走调控。 2. ATP敏感钾通道(KATP)：心肌缺血、缺氧开放。 3.钙激活钾通道(KCa)：参与血管张力调控。
配体门控离子通道
KACh
KCa
ACh作用于M受体 去极化、[Ca2+]i↑
KATP
细胞内 ATP/ADP↓
增加舒张电位 复极化或超极化 缩短动作电位时程
细胞上，当钙通道尚未激活时，钠通道已经失活。 ➢ 对离子的选择性较低：在细胞外Ca2+浓度（[Ca2+]o）下降
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Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
信号采集后的滤波
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据pass
Highpass
Bandpass
Notch
Electrical Interference
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示去除坏点
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
注意事项 （1）坏点太多时，应在记录前予以去除。 （2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示 在该框底部。 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前 后一些数据点（取决于Smoothing points，取3-99中的奇数）的 平均值赋予当前数据点，完成滤波。 Smoothing points值越大，数据幅度削减越大。 （3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均 值中所占的比例较大。 （4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。 （5）RC ( single-pole)：用于时域数据。 （6）8-pole Butterworth：用于频域数据。 （7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。
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Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Epoch A段
坐标零点
坐标零点
（1）Subtract mean of（去除均值法）（2）Subtract slope of（去除斜率法）
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Apr. 23-25, 2014
三、滤波 四、数据文件内部/之间的数学运算
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膜片钳实验数据的处理
一、基线的调零
基线的确认 全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。 • 单通道开放时间较长 • 所记录的时间较短 • 同时开放的通道数目较多且长时间持续开放 确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。 如何确定：膜片两侧液体、钳制电位
膜片钳技术高级培训班
Clampfit 10 膜片钳实验数据的处理与分析
内容
一、膜片钳实验数据的处理 二、全细胞记录数据的分析
三、单通道记录数据的分析
四、突触放电活动数据的分析
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Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
一、基线的调零
二、坏点的去除
通道开放
基线
单通道电流基线的确认 如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置
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Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
基线不在零点的原因 封接电阻的改变：漏电流 失调电位的存在：偏移、漂移
噪声的干扰：交流干扰
高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
基线调零方法 打开Analyze/Adjust/Baseline （1）Subtract mean of（去除均值法）：适用于去除直流偏移。 （2）Subtract slope of（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。 （3）Subtract fixed value（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。 （4）Adjust manually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。
人手靠近记录探头：高幅、高频。
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Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
坏点的赋值 （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的数值。 （2）Mean between cursor 1..2：Cursor 1-2之间均值。 （3）Mean between cursor 3..4：Cursor 3-4之间均值。 （4）Straight -line fit between cursor 1..2：Cursor 1-2之间的直线拟合值。 （5）Fixed value(pA/mV)：输入一个固定的数值。
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膜片钳实验数据的处理
（3）Subtract fixed value（去除固定值法）
（4）Adjust manually（手工调零法）
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Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
基线调零的注意事项 （1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数 情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。 （2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。 （3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。 建议最好在采集数据时就设法调整好基线。
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示基线调零方法
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
二、坏点的去除
坏点产生的原因 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。 电容瞬变电流：电容的充放电反应。 瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时） 手机来电：一过性高频。
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
三、滤波
信号采集前的滤波 全细胞通道电流记录：1-2 kHz 全细胞突触活动记录：10 kHz
单通道电流记录：10 kHz
动作电位记录：10 kHz
Patch clamp training class