结核病的实验室诊断方法
结核病的实验室诊断方法
作者：赵雁林
来源：《中国社区医师》2008年第01期
结核病实验室检查主要有；涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定、分枝杆菌基因分型、分枝杆菌血清学及核酸扩增检测等。
细菌学检查
细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量。
正确地采集、转送标本，是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提。
各种标本(痰液、血液、伤口分泌物和各种感染组织等)采集时应充分考虑到选择恰当合理的时问，考虑到可能存在的病原菌的性质，按要求采集标本，这样可使标本包含细菌，并为后续检验步骤打下良好的基础。
合格的痰标本在低倍镜视野里上皮细胞应25个。
涂片染色显微镜检查根据我国结核病防治规划的要求，对咳嗽、咳痰>13周或有咯血或血痰的肺结核可疑症状者，应留取3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)进行痰涂片抗酸染色检查。
即时痰为病人就诊时咳出的痰液：清晨痰为清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前1天晚睡前咳出的痰液。
留取的痰液标本常规涂片后，进行要尔－尼尔逊氏染色法(ziehl-Neelsen)染色。
分枝杆菌分离培养结核分枝杆菌是兼性需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH为6.5～7.2。
分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。
是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。
当前，我国普遍采用改良L-J(改良罗氏)培养基来分离培养结核分枝杆菌。
通常情况下，当每1ml标本中微生物含量达102～3 CFU(菌落形成单位)时，即可培养阳性。
分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪(MIGT、BacT/A1err、ESP)，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。
在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的祛污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。
孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。
分枝杆菌药物敏感性试验分枝杆菌药物敏感性试验对于结核病人合理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有积极的作用。
结核病耐药性监测可以为评估制定国家结核病控制规划和控制策略提供科学依据。
分枝杆菌菌种鉴定目前报道的分枝杆菌种类已有100多种。
经抗酸染色镜检确定为抗酸菌的培养阳性菌株，应该先接种改良罗氏(L-J)培养基进行增菌传代后进行传统方法的菌种鉴定。
传统方法进行分枝杆菌菌种鉴定，需要经过硝基苯甲酸(PNB)生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验，观察记录细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。
血清学检测
涂片染色显微镜检查方法有一定的局限性，因为它对处于相对进展状态的结核病诊断具有较强的特异性，但其灵敏度在不同实验室间有所差异。
另外，涂片染色显微镜检查需要病人重复送3次痰，这导致有些时候病人的依从性不良，并且涂片染色显微镜检查对涂阴病人、儿童以及肺外结核病不能够给予诊断，在涂片染色显微镜检查过程中，如果操作不当也可能导致实验室人员受到感染。
核酸扩增检测(NAAT)、荧光原位杂交以及荧光高压液相等快速方法，使得诊断结果报告时间缩短至2天。
作为因病原微生物感染所导致的结核病，在临床上利用免疫学方法检查宿主对分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌感染造成的免疫反应(抗原或／和抗体)，从而帮助临床医师进行鉴别诊断，有一定的实际意义；但由于结核分枝杆菌的生物特性及此类病原菌引起的人体免疫反应较为特殊和复杂，因此，目前结核病免疫学的检测结果，在结核病的临床诊治中，只能够作为辅助参考，不能作为结核病诊断和评价治疗效果的指标。
临床医师在参考免疫学检查结果的同时，应该同时参照结核分枝杆菌的传统微生物学检查(包括抗酸染色镜检，特别是分枝杆菌培养检查)的结果并参考其他临床检查手段所得到的结果进行综合判断。
分子生物学检测技术
分子生物学在医学领域取得的飞速发展，研究者也将分子生物学的原理引入了结核病实验研究范围。
聚合酶链反应(PCR)是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术，是生物医学领域内最有价值的研究手段之一。
目前对于结核病诊断有较高灵敏度和特异性的方法有：核酸杂交、16S核糖体基因的测序、应用高压液相色谱(HPLC)对细胞壁脂质(分枝菌酸)的分析以及核酸扩增法(hmplicor MTB、MTD Gen-Probe、SDA)。
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测方法金标准
肺结核实验室检测的金标准是基于培养和鉴定结核分枝杆菌。
以下是具体步骤：
1.痰液样本收集：患者需要提供早晨醒来时的深咳痰液样本，
以获得有效的细菌数量。
2.痰液预处理：痰液样本经过预处理，包括离心和去除杂质。
这一步通常包括液体化和浓缩痰液。
3.痰液培养：将预处理后的痰液接种到培养基上，通常是液体
培养基。
培养基中的结核分枝杆菌将逐渐增殖形成菌落。
4.鉴定：通过常规培养、染色和生化试验等方法，鉴定已培养
的菌落是否为结核分枝杆菌。
5.药敏试验：对已鉴定的结核分枝杆菌进行药敏试验，以确定
哪些药物对其具有抗菌作用，从而为治疗方案的选择提供依据。
此方法被认为是金标准，因为它能够准确检测到结核分枝杆菌，并且可以确定其对药物的敏感性，为结核病的诊断和治疗提供可靠的结果。
但是，该方法需要相对较长的时间（通常需要几周）来进行培养和鉴定，因此在临床实践中可能需要其他更快速的检测方法来尽早确诊结核病。
三种肺结核实验室诊断方法评估
三种肺结核实验室诊断方法评估发布时间：2023-02-24T03:39:06.796Z 来源：《医师在线》2022年32期作者：赵静2 田敏敏1 邓淑文1 李金方3 赵蓉芬1*[导读] 目的阐明LAMP技术联合痰涂片和培养检测在肺结核确诊诊断的价值，为制定和完善本区肺结核的防控指南提供依据.方法收集送检疑似肺结核患者痰标本563份，进行直接涂片镜检、固体培养和环介导恒温扩增检测（LAMP）检测。
赵静2 田敏敏1 邓淑文1 李金方3 赵蓉芬1*1苏州高新区人民医院检验科江苏苏州 2151292苏州市第五人民医院临床检验中心江苏苏州2151313苏州高新区疾病预防控制中心疾控科江苏苏州215011【摘要】：目的阐明LAMP技术联合痰涂片和培养检测在肺结核确诊诊断的价值，为制定和完善本区肺结核的防控指南提供依据.方法收集送检疑似肺结核患者痰标本563份，进行直接涂片镜检、固体培养和环介导恒温扩增检测（LAMP）检测。
结果检测563份结核门诊送检痰标本中，257份来自临床诊断肺结核病例痰标本，三种检测方法阳性率由高到低依次为：分子检测LAMP阳性率最高（53.7%），培养阳性率次之（47.5%），直接涂片阳性率最低（15.2%）；35例临床诊断肺结核患者三种方法检测同时阳性，占13.6%，培养和LAMP检测同时阳性率64例，最高（24.9%）；306份临床诊断非肺结核病例痰标本，272例三种检测方法检测未检到结核分枝杆菌，实验室检查阴性率占88.9%，假阳性率由高到低分别为LAMP检测5%，培养4.2%，涂片1%。
结论 LAMP（环介导恒温扩增）技术可以作为培养方法的替代技术，帮助临床医生早期诊断，确诊肺结核，并进行抗结核治疗。
【关键词】肺结核；涂片；固体培养；lamp2020 年苏州高新区发病率为 49.13/10 万，肺结核仍居苏州市法定报告甲、乙类传染病首位，防控形势仍旧严峻。
急需快速、准确、简便的诊断技术和预防结核病感染新疫苗、新药品的出现［1］。
结核实验室检查项目
结核实验室检查项目包括痰涂片、痰培养、结核菌素试验和胸部X线检查等。
1. 痰涂片：通过显微镜观察痰液中的结核杆菌是否存在，是诊断结核病的常用方法之一。
2. 痰培养：将痰液置于培养基上进行培养，检测结核杆菌的生长情况，可以确定病原体的种类和药物敏感性。
3. 结核菌素试验：注射结核菌素后观察皮肤反应，判断是否感染了结核杆菌。
阳性结果需要进一步确认是否为活动性结核病。
4. 胸部X线检查：通过X光照射胸部，观察肺部是否有结核病变，如结节、空洞等。
对于早期病变或隐匿性病变的发现具有重要意义。
这些检查项目可以帮助医生确定患者是否患有结核病，并指导治疗方案的选择和调整。
同时，这些检查也有助于监测治疗效果和预防结核病的传播。
结核病实验室检查
结核病实验室检查结核病是一种严重的传染病，通常由结核分支杆菌引起。
这种病菌会侵入肺部并引起肺结核，而也可以通过血液传播到其他部位，如淋巴、骨髓和肝脾等。
在许多地方，特别是在发展中国家，结核病仍然是一种普遍的疾病，因此及早诊断和治疗至关重要。
结核病实验室检查是确诊结核病的一种重要方法。
结核病实验室检查通常涉及多种类型的检测，例如：1.酸杆菌检测结核分支杆菌是酸杆菌，因此酸杆菌检测是一种常用的实验室检查方法。
该方法不需要复杂的设备并且具有高度的特异性和灵敏度。
患者的样本可以是咳嗽的痰液、唾液或肺组织，也可以通过胃镜获得胃肠液。
如果酸杆菌检测呈阳性，则可以确诊结核病。
但是，该方法也存在一些局限性，例如在一些情况下不能检测出结核分支杆菌，如某些菌株可以耐受某些药物。
2. 结核抗体检测结核抗体检测是另一种可以用于诊断结核病的实验室检查方法。
该方法通常使用ELISA（酶联免疫吸附试验）或其他类似方法检测患者的血清中是否存在结核抗体，如果测试结果呈阳性，则表示患者可能感染了结核分支杆菌。
但是，结核抗体检测的结果可能会出现假阳性或假阴性的情况，这限制了其在临床实践中的应用。
3.结核病PCR检测PCR检测是检查抗原核酸序列的一种方法。
由于PCR技术可以扩增极微量的DNA，并且非常特异和灵敏，因此可以检测出非常小的感染量。
在结核病中，PCR检测可以用于检测结核分支杆菌的DNA，以确认病原体的存在。
但是，该方法对样本中的DNA污染非常敏感，因此必须进行严格的实验室操作和质量控制。
总之，结核病实验室检查是确诊结核病的一种重要方法。
这些测试方法都具有不同的优缺点，并且结果可能受到许多因素的影响。
因此，必须在临床实践中综合考虑这些方法的结果和临床表现，以取得最佳的诊断结果。
同时，实验室技术人员必须受过专业培训，严格遵守操作规程，以确保准确诊断和最佳治疗效果。
结核病检查方法有什么
结核病检查方法有什么结核病是一种常见而且难以彻底治愈的传染病之一，其中主要的症状有咳嗽，咳痰以及咯血、胸痛等表现方式，所以当我们出现比较类似的症状时需要引起重视，及早的接受检查治疗，那么结核病检查方法有什么呢？下面我来和大家一起分享吧。
(1) 痰涂片镜检法是全世界的结核病实验室外都在使用的最基本的细菌学检查方法，其特点是简单、快速和价廉，当天出结果，但无法辨别死菌活菌;敏感性低，通常需5000-10000条菌/ml才能够得到阳性结果;特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，需要通过进一步试验才可确定是否为结核菌，有关这一方法的改进研究和评价很多，但由于检测原理的限制，不可能出现突破性的进展。
(2) 痰结核菌常规培养法：是鉴定死菌活菌的可靠方法，被誉为“黄金标准”。
缺点是时间长，需求周才能报出结果，且敏感性低，涂片阳性标本只有约80%培养阳性;特异性差，各种分枝杆菌均可生长，需结合药物敏感性试验和分枝杆菌菌种鉴定，才可确定是否为结核菌。
(3) 药物敏感性试验：用于鉴定结核菌对抗菌素结核药物的敏感性水平。
这项试验通常是在痰结核菌培养的基础上进行的，故需时更长。
(4) 分枝杆菌菌种鉴定：是根据不同分枝杆菌的理化特性，以生物化学的方法为主。
可以精确地鉴定分枝杆菌的不同菌种，但操作复杂，且个别试验使用的药品，有一定的危险性。
(5) 痰结核菌快速培养系统：20世纪70年代发展的一种新的结核病细菌学检查方法——痰结核菌快速培养、药敏系统。
该方法将阳性检出时间较L-J法明显缩短，从常规培养的8周缩短到3-14d，且具有操作简便、自动化强、灵敏度高等优点，在结核病的细菌学诊断中起到了重要作用，促进了结核病细菌学诊断的发展。
结核病检查方法有很多种，根据医院的不同和患者自身的情况的不同其方法也不能是统一的，即使是我们正常人最好也能定期做肺结核病的检查，日常多注意饮食，个人卫生，养成好的生活习惯，希望我的回答对您有帮助，祝您健康。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
结核病实验室诊断技术
GenoType MTBDR and 诊断结核感染及对利福 MTBDRplus；INNO- 平和异烟肼药物敏感性 LiPA Rif.TB
Frane; LW Scientific; Zeiss
诊断结核患者
Cepheid GeneXpert
诊断结核感染及对利福 平的耐药性
WHO推荐的结核新诊断技术
方法 DNA微阵列芯片法
有前景的几种新技术
❖ 分子诊断技术:GeneXpert（Cepheid公司） ❖ 分子线性探针技术:INNO-LIPA（Innogenetics公司） ❖ 反向点杂交技术:GenoType MTBDR （Hain Lifescience）
分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（亚能生物） ❖ 基因芯片技术：微阵列芯片法（博奥生物） ❖ 细胞免疫学技术：T-SPOT.TB（Oxford Immunotec公司）
目前诊断方法回顾
细菌学检测方法 ： 涂片、常规培养、快培 其他辅助检查方法：皮试、结核抗体
目前诊断方法的局限性
涂片的缺点： 敏感性低； 特异性差； 无法区别死菌与活菌
培养的缺点： 耗时久，一般需4~8周； 阳性率低，约30%~50%；特异性差， 无法区别MTB与NTM
皮试的缺点： 敏感性低特异性差 抗体检测缺点：敏感性低特异性差
新型诊断技术产品比较
企业 美国 Cepheid
比利时 Innogenetics 德国 Hain Lifescience 中国 亚能生物
中国 博奥生物
英国 Oxford Immunotec
方法
产品特点
GeneXpert
同时检测MTBC和判断利福平耐药； 快速；简便；安全
线性探针杂交法 （INNO-LIPA）
➢ 新的实验诊断技术可弥补传统方法的不足，提高诊 断的灵敏度和特异性，但各有缺点或不足，难以完 全满足临床检测需求，因此，新型结核杆菌诊断技 术及产品的研发势在必行。
结核病实验室诊断技术2017.10.13
• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
结核病实验室检测流程标准
结核病实验室检测流程标准结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传染性强，严重威胁人类健康。
为了及时发现和诊断结核病，实验室检测是必不可少的一环。
本文将从标本采集、实验室检测和结果判读三个方面，介绍结核病实验室检测流程标准。
一、标本采集结核病的标本采集是实验室检测的第一步，其质量直接影响后续检测结果的准确性。
标本采集应在严格的无菌条件下进行，采集的标本应包括痰液、胸腔积液、尿液、脑脊液等。
在采集痰液时，应让患者深呼吸数次，然后咳出痰液，避免口腔分泌物的污染。
采集胸腔积液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。
采集尿液时，应让患者在清晨第一次排尿时采集，避免尿液的稀释。
采集脑脊液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。
二、实验室检测结核病的实验室检测主要包括涂片法、培养法、PCR法等。
涂片法是最常用的检测方法，其操作简单、快速，但灵敏度较低。
培养法是检测结核分枝杆菌的“金标准”，其灵敏度高，但需要较长的培养时间。
PCR法是一种新兴的检测方法，其灵敏度高、特异性强，但需要较高的技术水平和设备支持。
实验室检测应在严格的无菌条件下进行，避免标本污染和交叉感染。
检测结果应及时记录和报告，确保患者能够及时接受治疗。
三、结果判读结核病的实验室检测结果应根据临床表现和其他检查结果进行综合判读。
涂片法和PCR法的阳性结果可以初步诊断结核病，但需要进一步的确认。
培养法的阳性结果可以确诊结核病，但需要排除其他细菌感染。
实验室检测结果应及时通知临床医生，以便制定合理的治疗方案。
综上所述，结核病实验室检测流程标准包括标本采集、实验室检测和结果判读三个方面。
标本采集应在严格的无菌条件下进行，实验室检测应遵循相应的操作规范，结果判读应综合考虑临床表现和其他检查结果。
只有严格按照标准操作，才能确保结核病的及时发现和诊断，保障人民群众的健康。