02 实验二 常见细菌种属的鉴定
临床常见细菌手工鉴定和结果判断
临床常见细菌的手工鉴定和结果判断一．细菌的鉴定步骤1、鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。
2、对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。
（我们这里一般都是预先纯化培养）+––+b）G，G，c，对待鉴定的菌种进行革兰染色，3、观察形态（Gc，Gb做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。
要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。
4、按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。
另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。
5、复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。
⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。
首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。
第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）乙醇脱色（染色液Ⅲ）95%第三步：用．第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）⑵．触酶实验(HO实验)：22a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。
要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。
临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。
⑶．氧化酶实验（Kovac实验）：a. 原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。
临床常见细菌的手工鉴定和结果判断
临床常见细菌的手工鉴定和结果判断一．细菌的鉴定步骤1、鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。
2、对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。
（我们这里一般都是预先纯化培养）3、对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c，G–b，G–c，G+b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。
要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。
4、按鉴定质控单的要求填写好病人XX，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。
另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以与有无溶血。
5、复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。
⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。
首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变⑵．触酶实验(H2O2实验)：a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。
要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。
临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。
⑶．氧化酶实验（Kovac实验）：a. 原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。
酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c使对苯二胺氧化，出现深兰色反应。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
菌株鉴定流程总结
学习总结各位领导好，从5月25号开始，在周老师的实验室已经进行了十多天的培训，让我学到很多。
现将我在实验室学习的情况总结汇报。
一、细菌鉴定流程：1.表观观察鉴定：培养24h的菌落观察，如：菌落形态（圆形、椭圆形等）、大小（直径多少）、表面光滑度（光滑和粗糙）和隆起情况（扁平，隆起，凸起等）、边缘整齐、菌落的透明度、菌落（菌落颜色及是否产生色素等）及培养基的颜色（培养基是否变色）等菌落的描述。
显微观察，观察单个菌的形态（杆状，圆形，椭圆形，螺旋形等），是否有芽孢，荚膜的情况。
染色观察，革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。
2.分子鉴定：细菌DNA的提取（试剂盒法）⑴将菌种接在适宜的液体培养基中，进行液体发酵，180rpm/min，24h培养。
⑵将摇瓶发酵的菌液加到1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，倒掉上清液。
⑶向菌体沉淀中加入200ul缓冲液GA，震荡，至菌体悬浮。
如果是革兰氏阳性菌，则向菌体中加入120ul的Tris盐酸缓冲液，再加入80ul溶菌酶，37℃，30min以上。
⑷向离心管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
⑸加入220ul缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑹加入220ul无水乙醇，充分震荡混匀15s，可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑺将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个离心柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑻向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑼向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑽重复操作步骤⑼。
⑾ 将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm 离心2min ，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测
菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测菌种鉴定是指通过特定的方法和手段，对样品中存在的真菌和细菌进行鉴定和分类的过程。
下面将介绍几种常见的菌种鉴定方法及手段。
1.形态学鉴定：形态学鉴定是根据菌落形态、菌丝形态和孢子形态等特征来鉴定菌种的一种方法。
常见的形态学鉴定方法包括裸眼观察、显微镜观察、染色观察等。
裸眼观察主要通过观察菌落的颜色、形状、质地等特征，结合菌丝形态进行初步判断。
显微镜观察可以观察到菌丝的形态、孢子的形状、颜色等细节特征，通过比对菌种鉴定手册等资料进行鉴定。
2.生理代谢鉴定：生理代谢鉴定是通过菌株在不同培养基上的生理代谢特点来鉴定菌种的方法。
常见的生理代谢鉴定方法包括生理生化鉴定、生长温度范围鉴定、碳源利用鉴定、氮源利用鉴定等。
通过测定菌株在不同培养基上的生长速率、产酶能力、酸碱度变化、利用不同碳源和氮源等特征，判断菌株所属的种属。
3.分子生物学鉴定：分子生物学鉴定是通过检测菌株的DNA序列来鉴定菌种的一种方法。
常见的分子生物学鉴定方法包括PCR技术、基因测序、DNA指纹图谱鉴定等。
通过提取菌株的DNA，选择合适的引物进行PCR扩增，再通过基因测序获得菌株的DNA序列，通过比对菌株的DNA序列与数据库中已知的菌种进行比对，确定菌株所属的种属。
4.免疫学鉴定：免疫学鉴定是通过检测菌株与特定抗原的反应关系来鉴定菌种的方法。
常见的免疫鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹等。
通过与特定抗原结合，通过特异性抗体的反应来进行菌种的鉴定。
5.生化鉴定：生化鉴定是通过检测菌株的生化活性来鉴定菌种的方法。
常见的生化鉴定方法包括生化试剂盒、色谱分析、质谱分析等。
通过检测菌株在不同生化试剂上的产物或反应物的变化，进行菌种的鉴定。
综上所述，菌种鉴定方法及手段包括形态学鉴定、生理代谢鉴定、分子生物学鉴定、免疫学鉴定和生化鉴定等多种方法和手段。
不同的鉴定方法可以互相补充，提高鉴定的准确性和可靠性。
细菌种属的分子鉴定
用16S rDNA方法鉴定细菌种属一、目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤（一）细菌基因组DNA提取1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μL TE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。
37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。
再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。
实验二 细菌的鉴定方法
❖ 目前应用较多的自动化鉴定系统主要有：
Vitek—AMS(Automated Microbic System ) 、Biolog、MicroScan、 Enterotube、MIDI、Sensititte、 Autoseeptor、Crystal等鉴定系统。
❖ 法国生物一梅里埃(Bio—Merieux)公司的Vitek—AMS系统 是应用最普遍的细菌自动化鉴定系统之一，可鉴定18 000多 种细菌。全自动鉴定是从接种、培养、读数到报告的全过程 自动完成，利用负压将菌液加入测试卡各孔，封口机封口， 置孵箱孵育，阅读器以665 nm波长每小时将测试卡拉出1次 对各孔底物进行光扫描，动态观察其变化，计算机将判读结 果与标准数据库比较得出鉴定结果。
4. 放射免疫测定技术。放射免疫测定(RIA，Radio immuno assay)是用放射性同位素标记抗原或抗 体，与相应的抗体或抗原结合后通过放射自显影 定性和定量抗原或抗体。
5. 免疫胶体金标记技术。胶体金是继酶、荧 光素和放射同位素后免疫标记技术中令人 瞩目的新标记物。胶体金是氯金酸 (HAuC14)在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的 作用下，聚合成特定大小的金颗粒，通过 静电作用与抗体或抗原形成一种稳定的胶 体状态，即为免疫金，免疫金与相应的抗 原抗体结合后，呈现特定的颜色反应。
2. 免疫酶技术。免疫酶技术(EIA，Enzyme immuno assay) 是将酶标记的抗抗体与抗原一抗体复合物结合形成抗原一 抗体一酶标记抗抗体复合物，加入酶底物产生有色产物。 以酶联免疫吸附测定(ELISA)和斑点酶联免疫吸附技术 (Dot—EusA)应用较广泛。
3. 免疫荧光技术 免疫荧光技术(FIA，Fuorescence immunoassay)是将一抗滴加于待检抗原上，再 加一抗的荧光抗体(二抗)，呈现特异性的荧光抗原 抗体复合物以鉴定病原菌。此法比ELISA更直观， 可直接观察到菌体形态。
简述细菌种属的分类鉴定流程
简述细菌种属的分类鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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进行细菌种属分类鉴定首先要进行样本采集。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
菌、普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试
管3支，操作同上。
接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进 入气泡。
将接过种的和作为对照的6支管均置于37℃培养24~48小时。
观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。
3、MR、VP试验
3、化学分类的常用方法
细胞（壁）化学组分分析 枝菌酸分析（诺卡氏菌）
磷酸类脂分析
脂肪酸组分分析 醌组分分析 全细胞蛋白SDS-PAGE分析 核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE）
4、分子分类
从分子水平上，对生物个体的DNA、RNA和蛋白质进
行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分
淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细 菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生 蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2、糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应， 在肠道菌的鉴定上尤为重要。 绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源， 但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能产 酸和气体，有的只产酸不产气。 发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8）变为黄色 （pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管 中有无气泡来证明。
实验二
常见细菌种属的鉴定
一、目的要求 二、基本原理 三、器材
四、操作步骤
五、实验报告
一、目的要求
1、了解常见细菌种属的鉴定程序 2、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法
二、基本原理
（一）微生物分类鉴定的方法—多相分类法 多相分类法：Colwell1970年提出，指利用微生物
多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育 的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多
加快反应速度。培养物呈红色者，为V-P反应阳性。
五、实验报告
1.
记录实验结果
P 118.1；P120.1 ；P123.1 根据实验结果推测1、2、3号菌种分别是何菌？
2.
思考题
（1）你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ （2）加入某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验是什么结果？ （3）为什么大肠杆菌是MR阳性，而枯草杆菌是阴性？这个实验，与V-P试验 最初底物与最终产物有何异同？为什么会不同？
类的方法。
DNA G+Ｃmol%
DNA 分子指纹分析
DNA-DNA杂交
核酸序列分析（16srDNA、ITS等）
（二）微生物的生理生化反应 1、淀粉水解实验
2、糖发酵试验 3、MR（甲基红）
4、V-P（伏-普）
1、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能
力不同，说明它们有着不同的酶系统。
生物进化的基础。
2、数值分类
是随着信息数字化时代的发展，根据微生
物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助
定义微生物分类单元的一种方法。
主要是向分类学家提供准确的、可重复的、
大信息量的处理手段。
3、化学分类
是研究微生物细胞不同化学特性，并利用
这些特性对生物个体进行分类和鉴定。
由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好， 因此化学分类是原核微生物系统分类学的主要 方法之一。
三、器材
1.
菌种
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌
2、培养基
固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基等 3、仪器或其他用具
四、操作步骤
1.
淀粉水解试验
将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃，无菌操作制成平板。 用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌 等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。
37 ℃倒置培养24-48小时 观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘 液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板
观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以
初步判断菌体解淀粉的活性。
2、糖发酵试验
用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基 名称和所接种的细菌菌名。
相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统
分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是 目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水 平上的分类单元的描述和定义。
1、传统分类法
也称描述分类，主要指以形态特征、培养
特征以及生理生化特征等表观分类指征，对微
生物分类单元进行的描述分类。
传统分类是认识微生物实际重要性和研究
3、MR（甲基红试验）
用来检测由葡萄糖产生的有机酸， 如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产 酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.3）变 为红色（4.2），即为甲基红阳性反应。
4、V-P VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产 生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。
此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气 氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的 胍基作用，生成红色化合物，即为VP试验阳性。
配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。 培养48小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲 基红试剂2滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色 者为阴性。
取另外一支培养48小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加
入5~10滴40%的KOH，然后加入等量的5%的a-萘酚溶
液，用力振荡，再放入37°温箱中保温15~30分钟，以