大规模表达序列标签(EST)测定及分析
EST序列
EST序列表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。
这一概念首次由Adams等于1991年提出。
近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。
在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。
克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。
而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。
文本将就EST 技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。
1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。
因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。
Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。
虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。
Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。
EST之详细介绍
Expressed Sequence Tags（ESTs）何谓Expressed Sequence Tags（ESTs）？从一特定细胞族群之mRNA转录而成的一群cDNA，经过single-pass的定序过程，而得到的一组序列。
此一细胞族群可以是特定的组织、器官，或是处于某特定发育状态或环境的细胞。
--- A set of single-pass sequenced cDNAs from an mRNA population derived from a specified cell population (e.g. a specific tissue, organ, developmental state or environmental condition).〈2〉ESTs之发展演进快速产生大量低质量的cDNA之概念在1980年代晚期被提出，此方法所能带来的利益，在当时并未能被普遍地认同。
提倡者认为这些cDNA序列能让很多新的protein-coding gene很快地被发现。
批评者则提出反驳，认为这些cDNA 序列将会遗漏掉许多原本能在genimic DNA中被找到的重要调控要素（regulatory elements）。
最后，还是由提倡cDNA定序的人赢得了胜利。
1991年时，有609个Expressed Sequence Tags（ESTs）首度被描述，而公用数据库（public databases）中ESTs的数量，更是呈现戏剧性的成长，到了1995年中，GenBank里ESTs records 的数量已超过非ESTs records的数量；2000年六月，四百六十万的ESTs records 已占了GenBank里所有序列的百分之六十二。
一开始，ESTs的来源只有人类；现在NCBI的EST database（dbEST）已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠（mouse）、大鼠（rat）、Caenorhabditis elegans和黄果蝇（Drosophila melanogaster）等。
EST介绍
表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。
这一概念首次由Adams等于1991年提出。
近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。
在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。
克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。
而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。
文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。
1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。
因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。
Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。
虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。
Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。
茶树新梢cDNA克隆测序和表达序列标签(ESTs)特性分析
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2005,13(1):21~25·研究论文·茶树新梢cDNA 克隆测序和表达序列标签(ESTs)特性分析*陈亮1***赵丽萍1**高其康2(1.中国农业科学院茶叶研究所农业部茶叶化学工程重点实验室，杭州310008；2.浙江大学分析测试中心，杭州310029)摘要：采用定向克隆法，构建了茶树((L.)O.Kuntze)龙井43和安吉白茶等2个品种新梢cDNA 文库。
对龙井43cDNA 文库共4320个克隆的序列进行了测定，获得有用序列2963个，其中空载体和去除载体后序列短于150bp 有416个，重复的有863个，首批共获得1684个茶树ESTs 。
绝大部分ESTs 的长度在300~700bp 之间，平均为478bp 。
通过与NCBI 等核酸数据库进行比对、查询和注释，获得已知功能基因或具推测功能的基因130多个(607个ESTs)，新的表达基因1077个，证明ESTs 测序分析是一个发现和鉴定茶树功能基因的高效快速新途径。
关键词：茶树；cDNA 文库；ESTs ；测序；新基因Sequencing of cDNA Clones and Analysis of the Expressed SequenceTags (ESTs)Properties of Young Tea Plant ()Shoots CHEN Liang 1***ZHAO Li-Ping 1**GAO Qi-Kang 2()The construction of two cDNA libraries of the tea plantcv.Longjing 43and Anji Baicha),the se-quencing of Longjing 43cDNA clones and the analysis of expressed sequence tags (ESTs)were reported.Totally,4320clones from the cDNA library of Longjing 43were sequenced and 2963useful sequences were obtained,corresponding to 68.5%.Four hundred and sixteen clones shorter than 150bp and 863repeated clones were excluded and the first 1684valid tea plant ESTs were generated.Most of the ESTs were between 300~700bp with an average of 478bp.Six hundred and seven ESTs with known or putative function were identified by BlastN searches against the NCBI non-redundant nucleotide databases,corresponding to more than 130functional genes in the tea plant.The rest 1077ESTs were partial or full novel gene sequences.The results indicated that ESTs sequencing was a high,rapid and effective approach to identify novel functional genes for teaplant.plant ();cDNA library;ESTs ；sequencing;novel genes*基金项目：国家自然科学基金(No.30070486)、浙江省重点科技项目（No.2004C22033）和浙江省留学人员科技活动项目资助。
EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签
EST (Expressed Sequence Tag）表达序列标签EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。
由于cDNA文库的复杂性和测序的随机性，有时多个EST代表同一基因或基因组，将其归类形成EST 簇（EST cluster)原理：EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。
EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
技术路线：首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo (dT) 作为引物进行RT-PCR合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA 文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST 序列的产生过程。
应用：EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA 序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。
同样，对于一个DNA 序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。
具体说，EST的作用表现在：⑴用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；⑵作为探针用于放射性杂交; ⑶用于定位克隆；⑷借以寻找新的基因; ⑸作为分子标记；⑹用于研究生物群体多态性；⑺用于研究基因的功能；⑻有助于药物的开发、品种的改良；⑼促进基因芯片的发展等方面。
表达序列标签EST分析及其在林木研究中的应用
林业科学研究 2004,17(6):804～809Forest Research 文章编号:100121498(2004)0620804206表达序列标签(EST)分析及其在林木研究中的应用李 虹1,2,卢孟柱2,蒋湘宁1(11北京林业大学,北京 100083;21中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091)摘要:简要叙述了表达序列标签EST技术的原理和流程,综述了EST在研究林木木材形成和其它生物学过程时新基因的发现、基因表达分析和基因芯片方面的应用进展以及在开发林木单核苷酸多态性和简单序列重复等分子标记和构建遗传图谱方面的应用进展,并对其在林木基因组研究中的应用前景进行了展望。
关键词:EST;新基因发现;基因表达;分子标记中图分类号:Q78 文献标识码:A1991年Adams等人从三种人脑组织的cDNA文库中随机挑取609个克隆进行测序,从而得到一组人脑组织的表达序列标签EST(ex pressed sequence tags),并将其与数据库进行序列同源性对比,结果表明:该组EST中有36个代表已知基因,337个代表未知基因,这是关于EST技术应用的首次报道,并首次提出了EST的概念[1]。
随着人类基因组计划的顺利进行,EST技术首先被广泛应用于寻找人类新基因,绘制人类基因组图谱,识别基因组序列编码区等研究领域,之后又被广泛应用于植物基因组研究[2]。
随着EST测序的飞速发展,到2003年6月,美国国家生物技术信息中心(NC BI)的EST数据库中(dbEST)(http:ΠΠw w w.ncbi.nlm.nih.g ovΠdbESTΠindex.html)已录入的来自不同物种的不同组织的EST共有17291123条,其中人和鼠的最多。
EST也被广泛应用于新基因的发现、基因鉴定、基因克隆、构建基因组图谱、基因定位分析、基因表达分析等方面。
在植物方面,除了拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)、水稻(Oryza sativa L.)、小麦(T riticum aesti2 vum L1)、大麦(Hordeum vulgare L.)、大豆(G lycine max(L.)Merr.)、玉米(Zea mays L.)、棉花(G os2 sypium herbaceum L1)等模式植物和农作物以外,近年来也开展了一些木本植物的EST研究,首先报道的是火炬松(Pinus taeda L.)EST分析,随后是杂交杨(Populus tremula L.×P.tremuloides M ichx.)和毛果杨(P.trichocarpa‘T rich obel.’)等其它林木。
cDNA文库与EST序列分析.ppt
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College of Life Science and Biotec研究具体某类特定细胞中基因 组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特 殊的优势。 2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、 细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更 为广泛的或同一种细胞在不 同功能状态下细胞的mRNA，将其中一种细胞的mRNA反 转录成cDNA第一链，然后将该cDNA与另一细胞过量的 mRNA进行杂交，第一种细胞中若存在不同于第二种细胞 的特殊基因，则会产生特殊基因的mRNA和cDNA，它们 不能与第二种细胞的mRNA形成杂交体。将未形成杂交体 的cDNA分出，合成与之互补的cDNAf Life Science and Biotechnology
方法三：PCR法
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cDNA的克隆
（1）修饰cDNA两端 （2）cDNA与载体相连 （3）导入宿主细胞:
重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存宿主细 胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状
College of Life Science and Biotechnol Science and Biotec惜生物资源 2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针 3)可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究
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基因表达分析
基因表达分析1、EST（Expressed Sequence Tag）表达序列标签（EST）分析1、EST基本介绍1、定义：EST是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，进行5’端或3’端进行一轮单向自动测序，获得短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为400bp。
EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此，EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
2、技术路线：首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo（dT）作为引物进行RT-PCR 合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST序列的产生过程。
3、EST数据的优点和缺点：（1）相对于大规模基因组测序而言，EST测序更加快速和廉价。
（2）EST数据单向测序，质量比较低，经常出现相位的偏差。
（3）EST只是基因的一部分，而且序列里有载体序列。
（4）EST数据具有冗余性。
（5）EST数据具有组织和不同时期特异性。
4、EST数据的应用EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比，更可能穿越家系与种的限制。
因此，EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用的。
同样，对于一个DNA序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。
具体说，EST的作用表现在：（1）用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；（2）作为探针用于放射性杂交；（3）用于定位克隆；（4）借以寻找新的基因；（5）作为分子标记；（6）用于研究生物群体多态性；（7）用于研究基因的功能；（8）有助于药物的开发、品种的改良；（9）促进基因芯片的发展等方面。
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二、序列测定及数据分析
随机挑取克隆进行5’或3’端测序
序列前处理
聚类和拼接
基因注释及功能分类
后续分析
EST软件平台
EST序列 库/序列的质量检查 测序量监控
全长ORF寻找
发现全长基因
聚类和拼接检查 （借助于基因组信息） 表达量分析
交替剪接检测
EST特有信息
功能分类
研究表达基因概况的主 要实验手段（DNA chip、 proteomics的先驱）
◆ 低丰度表达基因不易获得。
◆ 由于只是一轮测序结果，出错率达2%-5%；
◆ 有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或
是基因组DNA的污染；
◆ 有时出现镶嵌克隆；
◆ 序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大。
EST构建（可用于基因表达量的分析选择
根据不同的实验目的选择不同的测序方向：
◆
5’端
5’上游非翻译区较短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基 因或研究基因差异表达时用5’端EST较好，大部分EST计划都是 选用5’端进行测序的，而且从5’端测序有利于将EST拼接成较长 的基因序列。
◆
3’端
3’端mRNA有20－200bp的polyA结构，同时靠近polyA又有特异 性的非编码区，所以从3’端测得EST含有编码的信息较少。但研 究也表明，10％的mRNA3’端有重复序列，这可以作为SSR标记； 非编码区有品种的特异性，可以作为STS标记。
Reference: Bonaldo, M.F., et.al, 1996. Normalization and subtraction: Two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6: 791-806.
扣除杂交技术的发展
◆ 扣除杂交技术最早应用是在20世纪80年代初，当时的22, 135–139】和制备差异表达基 因的特异探针【PNAS. 81, 2194–2198】。差异表达的基因通过检测样本 cDNA(tester)和过量的对照样本mRNA (driver)的相互杂交而得到。在检测样本 cDNA (tester)和对照样本mRNA (driver)同时表达的基因会形成mRNA/cDNA 杂交分子，而检测样本特异表达的基因则保持单链状态。单链分子和双链分子 通过羟磷灰石层析而分离，分离得到的单链分子是检测样本特异表达的基因。 差异表，包括用生物素标记【Nucl. Acids Res 14, 10027– 10044】和oligo(dT)30-latex标记cDNA，以增加单双链分子的分离效率。后来， 通过PCR选择性cDNA扩增技术被应用到扣除杂交中，以克服以往扣除杂交中 需要大量起始mRNA的缺点，并可以同时提高基因克隆地效率【Nucl. Acids Res. 19, 7097-7104】 。 ◆ 扣除技术的进一步成熟是在1996年，Gurskaya 等(1996) 和Diatchenko 等 (1996) 同时发表了关于扣除杂交的改进方法，其主要的技术方法类似，这个技 术叫抑制性扣除杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH） 【Anal. Biochem. 240, 90–97; PNAS. 93, 6025-6230】 。
什么是 ESTs ？
ESTs（Expressed Sequence tags ）是从已建好的cDNA库 中随机取出一个克隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段进 行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。
EST的应用
1、ESTs与基因识别
ESTs已经被广泛的应用于基因识别，因为ESTs的数目 比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人员更容易在 EST库中搜寻到新的基因(Boguski et al., 1994). ● 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。
Clone 利用EST，SAGE分析结果 制作芯片（研究已发现 的基因） Gene Chip
读取光密度 表达量 矩阵
0.1 0.06 0.05 0.04 … 0 0 0.07 0.01 …
• Rice genomewide DNA chip (60,000+预测基 因) • 果蝇基因芯片 …
EST分析
（非翻译区由于不含有编码序列，与编码区保守序列相比所受到 的选择压力比较小，因而其多态性程度比较高，便于多态性位点 的选择以用于遗传图更多的信息含量，并且 在构建EST数据库时更有优势，同时有利于利用EST数据库聚类 完整的基因和阅读框的寻找，便于利用更敏感的蛋白质比较来寻 找同源基因。）
4、ESTs与SNPs
来自不同个体的非冗余的ESTs可用于发现基因组 中转录区域存在的SNPs。最近的许多研究都证明对 ESTs数据的分析可以发现基因相关的SNPs (Buetow et al., 1999；Garg et al., 1999；Marth et al., 1999； Picoult-Newberg et al., 1999) 。
● 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。 ● 已知基因的不同剪切模式的搜寻。【注：不过很难 确定一个新的序rg et al., 1997)】
2、ESTs与基因图谱的绘制
EST可以借助于序列标签位点(sequence-tagged sites) 用于基因图谱的构建. STS本身是从人类基因组中随机选 择出来的长度在200-300bp左右的经PCR检测的基因组中 唯一的一段序列。来自mRNA的3’非翻译区的ESTs更适合 做为STSs，用于基因图谱的绘制。其优点主要包括： ● 由于没有内含子的存在，因此在cDNA及基因组模板 中r subtraction of cDNA libraries the procedure is similar to normalization, except that the PCR products arise from a different library (whose genes are to be subtracted from the original library)
● 与编码区具有很强的保守性不同，3’UTRs序列的保守 性较差，因此很容易将单个基因与编码序列关系非常 紧密的相似基因家族成员分开。 （James Sikela等， 1991年）
3、ESTs与基因预测
由于EST来的一个基因的部分序列。使用合适的 比对参数，大于90％的已经注释的基因都能在 EST库中检测到(Bailey et al., 1998)。ESTs可以 做为其它基因预测算法的补充，因为它们对预 测基因的交替剪切和3’非翻译区很有效。
dbEST中数据量的增长
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
总EST条目 （million）
1993
1995
1997
1999
2001
时间（年）
● 93年前ESTs数据收录于GenBank，EBI和DDBJ。 ● 1993年NCBI(National Center of Biotechnology Information)建立了一 个专门的EST数据库dbEST来保存和收集所有的EST数据。
应注意区别真正的SNPs和由于测序错误（ESTs为 单向测序得来，错误率可达2％）而引起的本身不存在 的SNPs。解决这一问题可以通过： ● 提高ESTs分析的准确性。 ● 对所发现的SNPs进行实验验证。
5、利用ESTs大规模分析基因表达水平
EST技术流程
体内：翻译 体外研究：反转录
mRNA
蛋白质
cDNA
连接，
质量控制与数据分析
测序采样问题（SAGE）
Serial analysis of gene expression (SAGE) 技术流程
实 验 步 骤 较 多 要 求 较 高
反转录 酶切 连接
测序
单条测序＝＝对30－40条EST测序
分析
由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析： 基因表达量分析、寻找新基因等等
基因芯片或微阵列技术流程
反转录 原位 合成
…. ….
反转录（可选）
连接， 转化
标记 杂交
…………. …………. ………….
◆
两端测序 获得更全面的信息。
序列前处理 (Pre-processing)
1. 去除低质量的序列（Phred）
2. 应用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽数据组中不属于 表达的基因的赝象序列(artifactual sequences)。
●载体序列(ftp:///repository/vector)
● Digital Gene Expression Displayer (DGED) ● cDNA xProfiler
◆ 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE) 基因表达系列分析是一种用于定量，高通量基因表 达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE的原 理就是分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列 标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆 和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应的基 因的表达丰度。 ◆ DNA微阵列或基因芯片的研究 高密度寡核苷酸cDNA 芯片或cDNA微阵列是一种新 的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。 在许多情况下，cDNA芯片的探针来源于3'EST (Duggan et al., 1999)，所以EST序列的分析有助于芯片探针的设 计。
大规模表达序列标签（EST） 测定及分析
主要内容
1、什么是EST？ 2、EST的应用 3、EST序列测定及分析过程
大规模EST序列测定的开始
ESTs的来源