表达序列标签及其应用

EST序列

EST序列表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。

这一概念首次由Adams等于1991年提出。

近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。

在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。

而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。

文本将就EST 技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。

因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。

Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。

虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。

Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。

表达序列标签(est)在基因组学研究中的应用

表达序列标签(est)在基因组学研究中的应用序列标签（Sequence Tag）是指由DNA或RNA片段构成的一系列序列标记，它可以在遗传疾病、基因表达、信号转导等生命科学研究中发挥重要作用。

其中，表达序列标签（EST）是一种简单而有效的标记技术，它的应用在基因组学领域得到了广泛关注。

一、EST技术简介EST技术是一种由测序技术支持的高通量筛选技术，其主要原理是通过随机挑选某些不同的cDNA克隆来获得所需的不同的EST序列。

它的应用可以大大降低生物学研究的难度，也可以在较短的时间内获得大量的基因序列。

二、EST在基因组学研究中的应用（一）基因组注释及功能预测基因组注释是指对基因组序列进行生物信息学分析，以确定其中的基因区域和基因的结构。

EST技术可以通过对基因组序列的全长编码区域进行建库、测序和组装，从而确定基因的结构和位置，从而实现基因组注释。

（二）基因家族的发现和分类EST技术可以应用于表达的基因家族的发现和分类，例如受体基因、酶基因和转录因子基因家族等。

EST序列可以用作启动点，通过比对模式，可将同源序列聚类形成基因家族，并进一步研究其与环境、生长过程或其它生物学过程的关系。

（三）隐形基因的寻找传统的基因克隆方法主要寻找已知的基因进行克隆，而隐形基因（也称未知基因）的寻找则需要更为深入的研究。

EST技术可以通过测序与注释，从全基因组的角度分析，实现隐形基因的发现。

这可以为了解未知疾病的发病机制、发病率等方面提供重要支持和信息。

（四）基因调控机理的研究EST技术不仅可以应用于基因组学研究，还可以应用于表观遗传学——研究基因调控机理。

EST序列常常用于测定细胞特异性基因表达、基因表达的时间和空间分布等方面。

它对于异等基因的表达差异、组织特异性基因表达模式、静态和动态转录调控等具有重要的科研价值。

同时，它还可以用于筛选差异表达基因，并进一步研究其相关的信号传导机制、生长发育机制等。

三、结论在基因组学研究中，EST技术可以为高通量测序提供支持，并更好地揭示基因组结构和基因调控机制。

EST介绍

表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。

这一概念首次由Adams等于1991年提出。

近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。

在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。

而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。

文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。

因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。

Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。

虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。

Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。

分子标记技术的类型原理及应用

分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。

所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。

广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。

通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。

分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。

2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。

2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。

2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。

2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。

蛋白表达载体常用标签综述

蛋白表达载体系统重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域,尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。

GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类:B类，M类和Lv 类。

B类的表达宿主为大肠杆菌，M类的宿主为哺乳动物细胞，Lv类是慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。

除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几种主流的标签功能初步介绍如下：eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。

就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。

同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。

4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。

现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签

EST (Expressed Sequence Tag）表达序列标签EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。

由于cDNA文库的复杂性和测序的随机性，有时多个EST代表同一基因或基因组，将其归类形成EST 簇（EST cluster)原理：EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。

EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

技术路线：首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo (dT) 作为引物进行RT-PCR合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA 文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST 序列的产生过程。

应用：EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA 序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。

同样，对于一个DNA 序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。

具体说，EST的作用表现在：⑴用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；⑵作为探针用于放射性杂交; ⑶用于定位克隆；⑷借以寻找新的基因; ⑸作为分子标记；⑹用于研究生物群体多态性；⑺用于研究基因的功能；⑻有助于药物的开发、品种的改良；⑼促进基因芯片的发展等方面。

表达序列标签EST概要

表达序列标签EST概要摘要：随着EST研究的开展、深入，以及相关研究技术和分析手段的不断改进并走向成熟，EST 数据资源不断丰富，而其本身又具备独特的优势和多方面的利用价值。

本文介绍了EST序列的获取、加工、储存、分配、分析和释读的相关研究。

关键词：EST 表达序列标签聚类cDNA文库生物信息学从事对生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和释读，并综合运用数学、计算机科学和生物学工具，以达到理解数据中的生物学含义的目的。

随着人类基因组计划在世界范围内的开展，生物信息学作为一门热门交叉学科，不断地完善和发展起来作为一种强有力的工具，它在帮助我们对巨量的生物信息进行归纳和理解，从而揭示生命的奥妙的过程中发挥了重要的作用。

然而信息的爆炸增长，面对复杂和庞大的数据库，如何有效地地获取我们所需要的信息，充分利用这些已有的数据资源，加速基因克隆研究已成为一个富有挑战性的课题。

表达序列标签的广泛应用，为大规模进行基因克隆和表达分析提供了强大的动力，也为生物信息学功能的充分发挥提供了广阔的空问表达序列标签(EST，Expressed Sequence Tag)是指从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表了一个完整基因的一小部分。

Adams等人在1991年提出了EST技术，宣布了cDNA大规模测序时代的开始。

随着大规模的测序，EST数据呈指数级增长。

到了1995年中，GenBank里ESTs的数量已超过非ESTs的数量；2000年6月，将近460万的ESTs 已占了GenBank里所有序列的62%。

ESTs序列不止来源于人类，NCBI的dbEST （EST database）中已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠、大鼠、秀丽线虫和黄果蝇等。

除此之外，也有许多商业性的机构保存了一些属于机构内部不公开的ESTs 序列。

EST序列的制备EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

基因表达分析

基因表达分析1、EST（Expressed Sequence Tag）表达序列标签（EST）分析1、EST基本介绍1、定义：EST是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，进行5’端或3’端进行一轮单向自动测序，获得短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为400bp。

EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此，EST也能说明该组织中各基因的表达水平。

2、技术路线：首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo（dT）作为引物进行RT-PCR 合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST序列的产生过程。

3、EST数据的优点和缺点：（1）相对于大规模基因组测序而言，EST测序更加快速和廉价。

（2）EST数据单向测序，质量比较低，经常出现相位的偏差。

（3）EST只是基因的一部分，而且序列里有载体序列。

（4）EST数据具有冗余性。

（5）EST数据具有组织和不同时期特异性。

4、EST数据的应用EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比，更可能穿越家系与种的限制。

因此，EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用的。

同样，对于一个DNA序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。

具体说，EST的作用表现在：（1）用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；（2）作为探针用于放射性杂交；（3）用于定位克隆；（4）借以寻找新的基因；（5）作为分子标记；（6）用于研究生物群体多态性；（7）用于研究基因的功能；（8）有助于药物的开发、品种的改良；（9）促进基因芯片的发展等方面。