实验五 荧光抗体检测技术
免疫学检验技术—荧光免疫技术
荧光显微镜光路图
透射荧光光路(a)
落射荧光光路(b)
三、荧光抗体染色及结果判断
• 荧光显微镜检查（结果判断）
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
“-”：无或极微弱 “+”：较弱但清晰可见
“++”：明亮
“+++”：耀眼
对照光：“-”或“±”
为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基 苯、I-等 。 * 荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；
消除非特异性荧光（本底）的干扰。
• Stokes位移 荧光物质从激发态回到基态的过程中，由于部分能
量丢失而导致发射光波长比激发光波长，两者波长之差。 • 荧光偏振
荧光物质经单一平面的偏振光照射后，吸收光能并 发出单一平面的偏振荧光的现象。
知识目标
教学目标
1.熟练掌握：荧光抗体的制备及荧光抗体技术（重难点）。
2.掌握：常用的荧光物质，时间分辨荧光免疫测定（重点）、荧光偏振免 疫测定。
3.了解：荧光的基本知识、免疫芯片技术。
能力目标
1.掌握：荧光抗体技术标本的制作。
2.学会：荧光抗体染色与结果判断。
思政-素质目标
责任心、质控、生物安全意识、临床免疫学思维
（RB200 橘红）
CD4
三、关键技术
1.标本制作 2.荧光抗体染色 3.荧光显微镜检查 4.荧光抗体染色结果判读
标 组织切片：冷冻切片、石蜡切片 本 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 制 涂片：各种体液、穿刺液、细菌和细胞悬液 作 培养细胞：单层培养细胞
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细 胞结构欠清晰 石蜡切片：组织细胞结构清楚，抗原损失多
免疫荧光技术实验报告
免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术是一种通过将荧光标记的抗体与特定抗原结合来检测和定位生物分子的方法。
本实验旨在探究免疫荧光技术的原理和应用，并通过实验验证其可行性。
一、实验原理免疫荧光技术基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在本实验中，我们选择了一种常用的抗原-抗体反应，即兔抗小鼠IgG。
首先，将小鼠IgG注射到兔体内，兔体会产生针对小鼠IgG的抗体。
然后，将这些抗体与荧光染料标记，形成荧光标记的抗体。
当荧光标记的抗体与小鼠IgG结合时，可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
二、实验步骤1. 准备样本：将小鼠IgG溶解在缓冲液中，制备不同浓度的小鼠IgG溶液。
2. 固定标本：将小鼠IgG溶液滴加到载玻片上，使其均匀分布，并用乙醇固定。
3. 孵育抗体：将荧光标记的兔抗小鼠IgG加入载玻片上，与固定的小鼠IgG反应。
4. 清洗样本：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的抗体。
5. 观察结果：在荧光显微镜下观察载玻片上的荧光信号。
三、实验结果在实验中，我们观察到荧光显微镜下载玻片上出现了荧光信号。
荧光的强度与小鼠IgG的浓度成正比，即小鼠IgG浓度越高，荧光信号越强。
这表明荧光标记的抗体与小鼠IgG发生了特异性结合。
四、实验分析免疫荧光技术的原理是利用抗体与抗原的特异性结合来检测和定位生物分子。
在本实验中，我们成功地将荧光标记的抗体与小鼠IgG结合，形成荧光信号。
这表明免疫荧光技术可以用于检测特定抗原，并通过荧光显微镜观察到信号。
免疫荧光技术在生物医学研究中具有广泛的应用。
它可以用于检测病原体、研究细胞蛋白定位、诊断疾病等方面。
例如，在病原体检测中，可以使用荧光标记的抗体来检测病原体的存在和定位，从而提高病原体的检测灵敏度和准确性。
在细胞蛋白定位研究中，免疫荧光技术可以用于观察蛋白在细胞内的分布情况，从而揭示蛋白的功能和相互作用关系。
在疾病诊断中，荧光标记的抗体可以用于检测特定抗原的存在，从而帮助医生进行疾病的早期诊断和治疗。
免疫荧光技术试验流程
免疫荧光技术试验流程免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
免疫细胞荧光试验流程：1、细胞爬片制备1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中2）、细胞生长实现60％后取出盖玻片3）、用PBS清洗盖玻片3次4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖上盖子以防止蒸发）5）、用PBS清洗盖玻片3次6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）7）、干燥8—10小时，放入—20°C保管8）、试验前解冻爬片，在室温下用中性PBS浸泡10—15分钟注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。
在这种情况下，可以试验红色或红外的荧光素。
2、破膜1）、0.1％Triton孵育10min2）、PBS洗涤3次，每次3分钟3、抗原修复1）、用滤纸擦干细胞爬片2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液3）、在室温下孵育10分钟4）、用PBS洗涤3次，每次10分钟4、封闭1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）2）、37°C孵育30分钟3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）5、一抗孵育1）、用抗体稀释液稀释一抗，实现抗体制造商介绍的浓度2）、将稀释的抗体（介绍浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育过夜3）、用PBS洗涤3次，每次15分钟6、二抗孵育1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗2）、将稀释的抗体加到爬片上，37°C孵育30分钟3）、用PBS洗涤3次，每次8分钟7、染色1）、爬片上滴加稀释好的SABC—FITC或SABC—Cy3试剂2）、37°C孵育30分钟（避光）3）、用PBS洗涤2次4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min5）、用PBS洗涤3次6）、用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下察看结果。
荧光抗体技术
⑴荧光抗体技术抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
免疫荧光⑵免疫荧光测定抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法⑴荧光物质1）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。
只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。
常用的荧光色素有：⑴异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。
分子量为389.4，最大吸收光波长为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。
其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
⑵四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。
性质稳定，可长期保存。
结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
⑶四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。
与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
⑵其他荧光物质1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。
例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。
其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb 竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫荧光测试项目
免疫荧光检查可分直接法、间接法、夹心法和补体法。
1. 直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10分钟后弃去，使标本保持一定湿度。
（2）滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30分钟）。
（3）取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序经过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5 分钟，不时振荡。
（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
（5）立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度来判断免疫复合物的多少，常用半定量法，（-）阴性，无荧光；（±）高倍镜下似乎可见；（+）低倍镜下似乎可见，高倍镜下明显可见；（++）低倍镜下明显可见，高倍镜下清晰可见；（+++）低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；（++++）低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。
2. 间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。
如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10分钟后弃去，使标本片保持一定湿度。
（2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30分钟。
（3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5分钟，不时振荡。
荧光抗体标记_实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。
这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。
三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。
2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。
四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。
2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。
3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。
4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。
5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。
6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。
7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。
阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。
六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。
本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。
2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA)的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体（ANA)为例进行实习。
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称,能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞（如Hep—2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上.如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光.试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂.如需自行制备，方法如下：（1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞.冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2）Hep—2细胞抗原片制备:Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基.干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl.-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗人IgG抗体（FITC—抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
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RIB200
570
595～600
四甲基异硫氰 酸罗丹明
TRITC
550
620
橙红色
荧光显微镜光路图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二 实验内容： 荧光抗体法诊断猪瘟 荧光显微镜的使用
实验材料与试剂： 三 实验材料与试剂： 1．猪瘟荧光抗体： 购置于中国兽药监察所。 2．0.01Mol/L pH7.2PBS液 3．缓冲甘油：优级纯甘油9份和碳酸盐缓冲液1份 混合而成，高倍镜下观察使用。 4．碳酸盐缓冲液： 0.5Mol/L 碳酸钠 1份 0.5Mol/L 碳酸氢钠 3份 混合即可。 5．荧光显微镜
实验四 荧光抗体检测技术
一、实验原理
免疫荧光技术是血清抗体以化学方法与荧光素 结合后，仍保留其免疫特性，当带有荧光素的抗 体与抗原结合后，则在抗原的部位有荧光抗体的 沉着，在荧光显微镜下观察就可以看到发亮的荧 光。 常用的荧光素：
名称 异硫氢酸荧光 素 四乙基罗丹明 缩写 FITC 最大吸收波（nm） 490-495 最大反射波（nm） 520-530 呈现颜色 明亮的黄绿 色 橘红色
四 实验操作方法 ： 1．组织涂片（切片 切片）制作： 取一点猪瘟脾淋疫苗均匀的 切片 涂匀空气中自然干燥后，立刻在室温下放入纯丙酮固定 10min，取出后PBS液轻轻漂洗数次，自然干燥后染色。 如不能及时染色，可用塑料纸包好，放入低温冰箱中保 存。
2．荧光抗体染色： 滴加猪瘟荧光抗体（工作浓度）2~3 滴，以覆盖为度，放入湿盒中，37℃感作30min（切忌 染色液干涸）。以PBS液3×1min冲洗。 3．观察结果：染色片半干时，放置于荧光显微镜下 进行观察。 高倍观察：滴加缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察。
五 实验结果的判定： 将染色好的组织片置激发光为蓝光荧光 显微镜下观察。 阳性结果：呈明亮的翠绿色荧光。 阳性结果 阴性结果：无荧光或荧光微弱。 阴性结果
六 分析与讨论 免疫三大标记技术（免疫酶技术、免疫 放射技术、免疫荧光标记技术）在医学诊 断以及生物学进展研究中的重要应用。 请举例说明。
组织切片制作： 组织切片制作： 取新鲜的扁桃体与肾组织块， 用冰冻切片机制成5µm~7µm原冰冻组织切 片，粘于清洁的载玻片上（0.8 mm ~1.0mm），空气中自然干燥后，立刻在室 温下放入纯丙酮固定15min，取出后PBS液 轻轻漂洗数次，自然干燥后染色。如不能 及时染色，可用塑料纸包好，放入低温冰 箱中保存。