FACS细胞表型染色操作
细胞染色操作步骤及注意事项
细胞染色操作步骤及注意事项概述细胞染色是一种常用的实验手段，它可以通过标记细胞的某些特定结构或分子，帮助研究者观察和研究细胞的结构和功能。
本文档将介绍细胞染色的常用操作步骤及注意事项。
操作步骤步骤一：细胞固定1. 取出培养皿中的细胞载玻片。
2. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除培养基中的残留物质。
3. 使用细胞固定液（如4%的甲醛溶液）固定细胞，通常固定时间为15-30分钟。
4. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除固定液中残留的甲醛。
步骤二：细胞渗透1. 取出细胞载玻片中的细胞。
2. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除固定剂中的残留物质。
3. 在细胞载玻片上滴加渗透液（如0.1% Triton X-100），孵育10-15分钟。
4. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除渗透液中的残留物质。
步骤三：染色1. 取出细胞载玻片中的细胞。
2. 在细胞载玻片上滴加适当浓度的染色液（如DAPI染料），孵育时间根据实验需要而定（通常为5-15分钟）。
3. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除染色液中的残留物质。
步骤四：显微观察1. 将细胞载玻片翻转到显微镜载玻片上。
2. 加入一滴适当的封片液（如甘油/丙酮溶液）。
3. 用显微镜观察和拍摄细胞。
注意事项1. 操作时要注意佩戴实验手套和眼部防护设备，避免接触有毒或有害物质。
2. 细胞固定液需要根据实验需要和细胞类型进行选择，避免使用具有细胞毒性的固定液。
3. 染色液要根据需要选择，确保染色剂与研究对象的亲和力。
4. 操作过程中要注意细胞的温度和湿润度，避免细胞损伤。
5. 洗涤的PBS缓冲液要充分冲洗，避免残留物质对结果的影响。
6. 操作前要确保显微镜和镜头清洁，以获得清晰的观察结果。
7. 操作结束后要及时清理实验台面和工具，避免交叉污染。
结论细胞染色是一种重要的细胞学研究手段，通过本文档介绍的操作步骤及注意事项，可以帮助研究者正确地进行细胞染色实验。
合理的实验操作和注意细节能够提高实验结果的准确性和可靠性。
流式细胞多色分析
流式细胞多色分析流式细胞多色分析（FACS）是一种用于研究细胞表面标记物以及内部分子的强大技术。
它结合了流式细胞仪和荧光标记的抗体，可以同时检测和分析细胞群体中多种不同标记物的表达，为细胞免疫学、细胞生物学和肿瘤学研究提供了重要的工具。
FACS技术的核心是流式细胞仪，它可以将单个细胞按需流经一个光束，通过散射和荧光信号来对细胞进行检测和分析。
荧光标记的抗体被设计为特异性地结合到感兴趣的细胞表面标记物或内部分子上，使得这些细胞成为荧光标记阳性。
通过在细胞上结合多个不同的荧光标记抗体，可以同时检测和分析细胞中多个分子的表达或活性状态。
流式细胞仪利用激光器发射的光束照射通过的单个细胞，然后依据细胞对光的散射和荧光信号的反应，将细胞分类。
根据光的散射特性，细胞可以被分为前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。
FSC反映了细胞的大小，SSC反映了细胞的复杂性和内部结构的复杂程度。
这些信息可以通过流式细胞仪的散射信号获得。
除了散射信号外，流式细胞仪还可以检测荧光信号。
荧光标记的抗体可以结合到特定的细胞表面标记物或内部分子上，并与特定的荧光染料结合。
这使得可以区分荧光标记阳性和阴性的细胞。
在FACS分析中，可以使用多达20个不同的荧光染料，以便同一时间检测多个标记物的表达。
每个荧光染料将与特定的激光器配置在一起，以便在不同的波长范围内激发。
当染料结合到靶细胞时，它们会发出荧光信号，这些信号可以在不同波长上被散射光探测器捕获。
通过收集这些荧光信号并解析它们，可以获得有关细胞表面标记物或内部分子的详细信息。
例如，可以分析细胞免疫表型，确定细胞在免疫系统中的类型和状态。
此外，还可以分析细胞周期、细胞凋亡、蛋白质结合和活化态等多个因素。
流式细胞多色分析在生命科学研究和临床诊断领域发挥了重要作用。
它可以帮助研究人员理解细胞的功能和行为，发现新的标记物和路径，研究细胞分化和肿瘤发展的机制，以及评估治疗效果和药物递送。
在临床上，流式细胞多色分析可以用于检测血液病变、免疫缺陷病和肿瘤的诊断和监测。
FACSCalibur双色荧光检测简易操作步骤
FACSCalibur双色荧光检测简易操作步骤一、开机（见开机程序）二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件1）在屏幕下方点击CELLQuest（第四个图标）启动软件。
桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。
2）从工具板中点击散点图图示。
在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。
出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。
3）在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。
4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024； Y轴：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)。
说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。
在图中，横坐标X轴和纵坐标Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；双荧光标记时，第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024，X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数， Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。
仪器使用者可因实验需求来修改所有图谱中显示之参数。
修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。
5）在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。
6）从工具板中点击直方图图示，在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。
facs技术操作规程
facs技术操作规程
《FACS技术操作规程》
流式细胞仪（FACS）是一种用于细胞分析和分选的高级仪器。
它可以分析、计数和分选细胞，对于细胞学和免疫学研究非常重要。
在使用FACS技术时，操作规程非常重要，可以确保实验的准确性和可重复性。
首先，操作人员需要准备好实验所需的样本和试剂。
样本可以是细胞悬液或者组织细胞悬液，而试剂包括细胞染色剂、抗体等。
在进行实验前，要确保所有试剂和仪器都是干净的，并且符合实验要求。
其次，需要根据实验设计设置FACS仪器。
这包括设置激光器的参数、选择合适的滤光片和检测通道，以及校准仪器。
合理的仪器设置可以确保后续实验的准确性。
接下来，操作人员需要将样本加入到流式细胞仪中进行分析。
在分析过程中，要确保样本被均匀地分散，并且避免气泡的产生。
此外，要根据实验目的选择合适的参数进行数据采集。
最后，如果需要进行细胞的分选，操作人员需要进行细胞的标记和排序。
细胞标记可以使用荧光染料或者特定的抗体，而排序可以根据细胞的特定荧光信号进行。
在进行分选时，要确保细胞的纯度和活性。
总之，FACS技术操作规程对于实验的成功至关重要。
遵循规
程可以确保实验结果的准确性和可重复性，同时也可以降低实验中的操作失误。
因此，操作人员在使用FACS技术时应该严格遵守相关规程，并按照标准操作步骤进行操作。
facs流式细胞仪原理
facs流式细胞仪原理FACS（Fluorescence Activated Cell Sorter）流式细胞仪是一种用于实现单细胞分析和分选的高精准度检测仪器。
它集成了光学、机械、电子等多学科技术，使得单细胞的多参数特征分析成为可能。
FACS流式细胞仪的主要原理是利用单细胞流经聚焦激光束时产生的荧光信号，快速捕捉并转化成电信号，同时在流式细胞仪中运用微处理器生产、分析、处理和保存数据结果，以达到准确实现异常细胞检出和分选的目的。
FACS流式细胞仪的主要部分包括激光、样品注入装置、光学系统、电子系统等。
首先，样品注入装置将待检测样品以极低速度喷入流动液体流（流体）中形成细胞单层行列并输送到单细胞流式细胞仪核心部件。
然后，经过激光器部分生成高纯度的激光光源通过曲角镜反射和透镜聚焦在样品中。
样品中的细胞经过激光激发后，能够发射出来与激光各自预设的波长的荧光信号。
然后，利用荧光探测器接收、传导和转化荧光信号为电信号并传输到计算机中分析，从而得到关于样品中细胞数量、形态、大小和荧光强度等信息的数据结果。
FACS流式细胞仪采用多参数、多波长分析技术，可以同时分析多个生物分子，如蛋白质、核酸、细胞膜分子等。
并且还可以采用不同荧光染料的标记来同时检测多种细胞生物体标志物，这无疑提高了FACS流式细胞仪的多重参数分析的准确性，并能减少误报率和漏报率。
FACS流式细胞仪广泛应用于生命科学领域，如肿瘤学、免疫学、细胞生物学、病毒学等。
例如，采用FACS流式细胞仪可获得肿瘤细胞的表面分子、细胞周期和凋亡率等信息，通常用于肿瘤诊断和治疗的预测。
在免疫学领域，FACS流式细胞仪可用于单克隆抗体制备和淋巴细胞发育等生物学研究。
在细胞生物学领域，FACS流式细胞仪可用于细胞分析，确定不同细胞类型和增殖程度，预测细胞代谢等问题。
总之，FACS流式细胞仪是一种功能强大的研究工具，可以在分析过程中应用多参数、多荧光染料和多波长分析技术，实现细胞数量、大小、形态、表面分子、内源性物质、外源性物质等多个维度的分析。
FACS 胞内染色
流式胞内染色实验方法方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。
不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色实验材料：12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。
实验流程：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。
缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。
斡旋分散细胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。
室温避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
FACS的原理及应用操作
Q S Q1 T T Q2 Q3 Q4
Ga te Compos ition (% ): Calc ula te d 3 P art Diff.
9 8% o f a l l lymp h ocyte s are in the ga te P ercen t Lymp h Con versi on n O
E v e nts ac quired: 1 20 00 Con v Ga te d E v e nts : 2 47 7
%L 1 18 50 30
S T T
[1]
Data s e t:
FSC S SC 1 13 17 FL1 FL2 Ma rke r 86 82
Me a ns :
Con v S ub set Na me %L T ota l T (CD3+ ) L ymp ho cyte s 48 T He lp e r (CD3 +, CD4 +) L ym ph o cytes 1 8
1 04 00 2 .03 E v e nts( ac 34 18 ) E quired: 1 20 00 Ga te d E v e nts : 2 32 8
Data s e t:
样品处理--常见影响因素
LeucoG ATE
P ati en t Na me :
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro1.软件，选择“联机”。
Acq Connect（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；（2） 对实验样本进行命名；（3） 对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3. 画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几够选中图形），将 改为 ,更改横纵备注：第一个散点图横坐标为FSC ，纵坐标为SSC 。