水分和盐胁迫下平邑甜茶根系细胞程序性死亡研究
水分胁迫对柑橘叶片和根系细胞超微结构的影响
水分胁迫对柑橘叶片和根系细胞超微结构的影响作者：王蓓蕾来源：《科学与财富》2015年第13期摘要：随着我国现代经济的不断发展，果树养殖业也在快速发展过程中。
但是由于我国版图较大，各地区的气候条件存在较大差异，对于果树的繁殖和生长具有着较大的影响，其中北方和西北地区土质水分较为稀少，产生的水分胁迫情况较为严重。
本文即是对水分胁迫对柑橘叶片和根系细胞超微结构的影响进行分析，分别选择枳橙、山下红、沙田柚这三种柑橘品种作为样品。
分别在水分含量60%、40%以及20%的情况下对其叶片和根系进行水分胁迫处理，了解在不同水分含量情况下水分胁迫对柑橘叶片和根系细胞造成的损伤程度，以期能为相关工作提供参考。
关键词：柑橘；叶片细胞；根系细胞；水分胁迫；超微结构水分胁迫是一种植物本身水分散失超过水分吸收的情况，当植物的细胞内水分流失量逐渐加大时，其细胞内的代谢功能就会受到影响，甚至会导致细胞结构遭到破坏，甚至导致气孔关闭，叶绿体和线粒体破裂等情况，对植物细胞的威胁性较大。
1、实验材料本次研究当中所选用的实验材料主要为三种柑橘，分别是枳橙、山下红和沙田柚。
2、实验方法在实验开始前，首先要对实验用的土壤进行配置。
选取普通的河沙、棉籽壳，将其与普通的果园土壤按照比例进行混合，并且将其放入设定为70℃的烘干箱内进行烘干，一般烘干时间为7天。
然后取容量为1升的培养钵，在其中装入已经干燥后的培养土质，并且在每一个培养钵当中植入一株幼苗，并称量其重量。
随后对幼苗进行充分的浇灌，直至培养钵中的土壤吸饱水分之后再对其进行称取，将培养钵的干重和浇灌后的重量进行对比，得出培养土壤能够达到的最大持水量。
第三，将浇灌后的植株转移入温室当中进行培养，待其完全成活之后，将其再次转移到恒温箱当中进行培养，恒温箱温度设定为30℃，在此过程中禁止对植株进行浇灌，并对其进行水分胁迫处理。
在培养的7天当中，每隔两天称量培养钵的重量，并将其与浇灌后重量相比，得出的数值再与原有持水量进行对比就能够得出土壤当中的含水比率。
中国科学家在植物程序性细胞死亡领域取得重要成果
中国科 学家在植物程 序性 细胞 死亡领 域取得重 要成 果
２０１８年６月３０日，中科 院遗传与发 育研究所李家洋研究组和 中国农科 院作物所万建 民研 究组分别 以 拟南芥为材料揭示 了苹果酸介导ＰＣＤ发 生的重要机制 ，解析 了ＰＣＤ过程 中叶绿体和线粒体之 间的信号传 递途径 ，首次提 出并证 明了植 物程序性细胞死亡过程 中存在叶绿体．线粒体的信 号传递途径 ，苹果酸在 其 中发挥关键作用，为设计高抗和高产作物起指导作用。李家洋等研究表 明，苹果酸的增多会促进拟南 芥ＰＣＤ过程 ；而万建 民等研究表 明，苹果酸能防止穗顶部小花退化 ，抑制ＰＣＤ过程 。原因可能是 ：苹果 酸在植物体 内存在稳态，不 同浓度的苹果酸对ＰＣＤ的调控作用不 同，苹果酸在植物不 同生长 时期或器官 的作用有差异或其亚细胞定位有差异。李家洋等发现叶绿体合成的苹果 酸转运至线粒体 后调控ＲＯＳ的产 生 以及ＰＣＤ；万建 民研究组发现质膜定位的苹果酸转运蛋 白突变导致ＰＣＤ，这可 能是细胞质 中苹果酸浓 度改变导致的表型。上述两项研 究解析 了植物程序性细胞死亡过程 中细胞器之 间协同作用的分子机制 ， 为后续研究奠定 了重要基础 ，是调控ＰＣＤ机制的重大突破 。固
在缺硼 的情况下也容易增加钙 的吸收难度 ， 因此 要 注 意 补 充 硼肥 ，可 选 用 市 面上 较 好 的硼 肥 喷洒 。 ３．５ 合 理控 制棚 内温湿 度
建议棚 内温度控制在较 为合理 的范 围， 日温 在 ２５～３０ ℃ ，夜 温 在 １５～１８ ℃ ，并适 量 通 风 ， 降低空气湿度 ；阴天时也要适 当进行通风 ，以降 低空气湿度并适 当换气。 图
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植 物 保 护
Ｖｅｇｅｔａ，随着电导率 的升高 ，番茄脐腐病 的发 生率也会升高。其 中不 同的品种对高盐分 的敏感 度 不 同 ，所 以不 同 品种 间脐 腐病 的发 生差异 较 大 。土壤ｐＨ值过低或过高也会影响钙 的吸收 ，在 ｐＨ值 为５．６～８．０的条件下钙元素的有效性含量 随 ｐＨ值 的升高而增高。 ２．５ 温 湿 度不适 宜
盐碱胁迫对果树的危害及其分子机理研究进展
盐碱胁迫对果树的危害及其分子机理研究进展作者：郝兰兰李小兰王鸿来源：《甘肃农业科技》2022年第03期摘要：盐碱胁迫是影响果树生长发育最严重的限制因子之一。
果树受盐碱胁迫后根系生长受阻、叶片变小、发育迟缓，造成植株矮化、早衰甚至死亡。
从细胞膜透性、POD、SOD等生理特性方面分析了果树对盐碱复合胁迫的响应机制，多角度分析了果树抗盐碱的分子机理。
关键词：果树;盐碱胁迫;生理特性;分子机理中图分类号：S156.4 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2022）03-0001-05doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.03.001Research Progress on Response Mechanism of Fruit Trees Under SalineAlkali StressHAO Lanlan 1，2， LI Xiaolan 1，2， WANG Hong 1，2（1. Institute of Fruit and Floriculture Research， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070， China; 2. College of Horticulture， Gansu Agricultural University，Lanzhou Gansu 730070， China）Abstract：Salt-alkali stress is one of the most serious limiting factors affecting the growth and development of fruit trees. The root growth of fruit trees under salt-alkali stress was blocked， leaves became smaller， growth retarded， resulting in plant dwarfing， premature senility and even death. In this paper， the response mechanism of plants to salt-alkali combined stress was analyzed from the aspects of osmotic regulation， cell membrane permeability、 POD、 SOD、 etc. And the molecular mechanism of salt-alkali resistance of fruit trees was summarized from various angles.Key words：Fruit tree;Salt and alkali stress;Physiological characteristic;Molecular mechanism果树是重要的经济树种，中国是世界上水果种植面积和产量均居首位的国家，果树产业产值居种植业的第3位[1 ]。
CTAB法原理
CT AB法原理CTAB(hexadecyltrimethy lammonium bromide，十六皖基三甲基漠化住），是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚桔的特性。
在高高子强度的溶液中（＞O.7mol/L NaCl), CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，盼类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCI (pH8. 0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；E D T A整合g2＋或n2＋离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；巳－就基乙醇是抗氧化剂，有效地防止盼氧化成醒，避免褐变，使盼容易去除PVP （聚乙烯P比咯烧嗣）是盼的络合物，能与多盼形成一种不溶的络合物质，有效去除多盼，减少D NA中盼的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用盼抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNas巳的降解作用。
用苯盼处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯盼相似相溶．蛋白分子溶于盼相，而DNA溶于水相。
使用盼的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。
缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分po ly(A)RNA.2.不能完全抑制RNase的活性＠氯仿的作用？氯仿：克服盼的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量盼．（盼易溶于氯仿中）用盼氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在盼氯仿中力口少许异戌醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戌辟有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定．用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如Na Cl或NaAc,Na＋中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
平邑甜茶幼苗生长、根构型及吸收特性的容器调控
范伟国 , 杨洪强 3
(山东农业大学园艺科学与工程学院 , 作物生物学国家重点实验室 , 山东泰安 271018)
摘 要 : 以平邑甜茶 [M a lus hupehensis ( Pamp. ) Rehd. ] 幼苗为材料 , 研究了栽培容器形状对幼苗新 梢生长 、幼苗根构型特征及根系营养吸收特性的影响 。结果显示 , 生长在 “深窄盆 ”中的幼苗新梢生长量 最大 , 主根粗 , 侧根多且短 , 毛细根丰富 , 对钙及锌的吸收能力较强 , 但根系活力及根系对磷 、铁的吸收 能力较弱 ; “等高径盆 ”中幼苗新梢生长量小 , 根冠比接近 1, 主根细短 、一级侧根少且粗长 , 对钾的吸收 能力较强 ; “浅宽盆 ”幼苗根冠比最大 , 一级侧根数量 、长度和粗度居中 , 二级侧根粗长 , 根系活力及根 系对磷 、铁的吸收能力较强 , 但对钾 、钙及锌的吸收能力弱 。
各处理每次取样 5 mL。试验重复 3次 。 根构型参数的测定 : 用千分尺测量主 、侧根粗度 , 用米尺测量主 、侧根长度 ; 用 W inRH IZO 软件 协助测量各级侧根及毛细根数量 (根直径小于 0125 mm 的所有根系的总称 ) 。根冠比通过根系质量 / 地上部质量计算 。 所有数据经过 SAS数据分析软件处理 , 多重比较采用 LSR 法 (Duncanπs法 ) 。
同时由于盆的横向空间宽阔有利于根系在水平方向拓展侧根也比较长这样不论主根生长量还是侧根生长量都比较大从而使浅宽盆中的幼苗根冠比在3种容器中最大表1这也表明浅宽盆利于幼苗根系的生长
园 艺 学 报 2009, 36 (4) : 559 - 564 Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 09; 修回日期 : 2009 - 03 - 03 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571285, 30671452) ; 教育部留学回国人员科研启动基金项目 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hqyang@ sdau1edu1cn)
干旱胁迫对新疆野苹果及平邑甜茶生理生化特性的影响
中国农业科学 2007,40(5):980-986 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2006-04-20；接受日期：2006-09-12基金项目：北京市重点实验室“果树逆境生理与分子生物学实验室”资助项目作者简介：谭冬梅（1972-），女，江苏常熟人，博士，研究方向为果树逆境生理与分子生物学。
E-mail ：dongmeitan@干旱胁迫对新疆野苹果及平邑甜茶生理生化特性的影响谭冬梅1，2（1中国农业大学园艺植物研究所，北京 100094；2潍坊学院生物工程学院，潍坊 261061）摘要：【目的】研究干旱胁迫能否诱导新疆野苹果和平邑甜茶发生细胞程序性死亡。
【方法】采用20%聚乙二醇（PEG6000）模拟干旱处理苹果属植物平邑甜茶（Malushupehensis pamp Reld.）和新疆野苹果（M. sieversii (Ledeb) Roem.）。
【结果】NBT 染色结果表明，平邑甜茶叶片在处理1 d 后开始有染色斑出现，4 d 后叶片几乎被全部染色；新疆野苹果叶片在处理3 d 后开始有染色斑出现，7 d 后叶片几乎被全部染色。
叶片萎蔫情况观察可以看出：平邑甜茶在处理3 d 后开始萎蔫， 4 d 后叶片干枯、整个植株死亡；新疆野苹果在处理6 d 后开始萎蔫，7 d 后整个植株死亡。
两个苹果种的叶片相对电导率随处理时间的延长逐渐上升；平邑甜茶在处理3.5 d 后相对电导率增幅明显加大，而新疆野苹果在处理6 d 后才明显增大。
平邑甜茶在处理后DNA 和RNA 含量就开始明显下降，而新疆野苹果下降速度缓慢。
【结论】0.1% NBT 染色、相对电导率测定、DNA 含量和RNA 含量测定等生理生化指标不仅可以作为鉴定苹果属植物在水分胁迫条件下发生细胞程序性死亡的指标，而且可以作为衡量苹果属植物抗旱性及衰老的参考指标。
关键词：苹果属植物；干旱胁迫；细胞程序性死亡；生理生化指标The Physiology and Biochemistry of Programmed Malus siversii andM. hupehensis Cell Death under Drought StressTAN Dong-mei 1,2(1Institute for Horticultural Plants ，China Agricultural University, Beijing 100094; 2Department of Agriculture and Engineering, Weifang University, Weifang 261061)Abstract : 【Objective 】 The object of the study was to observe the relationship between drought stress and programmed cell death. 【Method 】 Twenty percent of polyethylene glycol(PEG6000) was used to simulate drought stress to treat the seedlings of Malus sieversii and M. hupehensis . 【Result 】 NBT dyed reaction showed that M. sieversii leaves began appearing dyed spots 1 day after being treated. Its area expanded 4 days later, but these occurred in M. hupehensis at 1st and 7th day after the treatment, respectively. The seedlings of M. sieversii started to wilt at the 3rd day after treatment and died after 4 days. Seedlings of M. hupehensis began to wilt after 6 days treatment and died on the 7th day. The contents of DNA and RNA in leaves of M. hupehensis decreased rapidly after treatment, but it only happened in M. sieversii, 7 days after being treated. 【Conclusion 】Physiology and biochemistry indexes could not only identify Malus’ programmed cell death. Instead, they measured the plants sensitivity to drought stress as well as reflected the plant resistance to drought stress and senescence in Malus.Key words : Malus ; Drought stress; Programmed cell death; Physiology and biochemistry parameters0 引言【研究意义】细胞程序性死亡存在于植物的根、茎、叶、花、果实之中，并伴随植物生长发育的始终，植物的程序性死亡是从近十几年才开始研究的。
植物中程序性细胞死亡研究进展
程序性细胞死亡 ( Progra mm ed cell death, PCD ) 也称细胞 凋亡 (A poptosis), 是细胞在一定的生理或病理条件下, 为了 维持内环境稳定, 更好地适应生存环境而采取的一种由基因 控制的细胞主动的、 有序的死亡 。植物和动物在抗菌反应 过程中, 经常伴随着 PCD 和其他防卫机制的产生 [ 2] 。在植 物中, 程序性细胞死亡通常被定义为超敏反应 ( H ypersensi tive Response , HR), 植物能识别某些病原菌 , 通过限制感染 部位的病原菌生长来防止病原菌的传播, 达到防病抗病的目 的。 HR 的产生导致植物被感染组织周围出现坏死细胞 , 水 杨酸的合成增加, 抗微生物剂 ( 如病理相关蛋白和植物抗毒 [ 2] 素等 ) 积聚 , 限制病原物的扩散 , 使得整个植物得以保护。 发生 PCD 的细胞有其独特的形态学特征, 主要表现为: 细胞 骨架破坏 ; 细胞体积缩小, 密度增大 ; 染色质边缘化, 高度凝 集; 核内 DNA 降解并最终形成膜包围的致密凋亡小体; 在 DNA 电泳上常可见到典型 梯子形状 ( DNA ladder); 植物 细胞核 DNA 断裂 , 形成 3 OH 端 ; 凋亡的细胞保持细胞膜的 [ 3] 完整性, 没有细胞内含物溢出 。大量研究表明, PCD 对维 持生物体正常生长、 发育等具有举足轻重的作用。由于对植 物 PCD 的研究起步较晚 , 人们对其发生发展机制仍不甚清 楚。为此 , 笔者主要对近年来 PCD 的分子调控机制研究进 行综述, 以期为相关研究提供参考。 1 PCD的重要性 植物正常生长、 发育的重要环节 PCD 在植物体的整个生长发育过程中普遍存在。植物 从胚胎发育到根、 茎、 叶、 花等器官的发育形成 , 细胞在不断 增殖、 分化的同时都伴随着 PCD 的发生 。胚胎是植物新 生命活动的起点。在植物胚的发育过程中, 会有不同类型的 细胞发生凋亡。胚柄细胞: 胚柄是被子植物受精卵第一次分 裂时形成的, 能建立并保持胚的极性 , 并为胚的发育提供营 养和生长调控因子。当胚发育至一定阶段, 胚柄的作用结
盐胁迫下植物水分平衡调节机制的研究
盐胁迫下植物水分平衡调节机制的研究盐胁迫是指土壤中盐分过高，超过植物正常需求的情况，会导致植物生长受到极大影响，甚至死亡。
盐胁迫是全球干旱地区普遍面临的问题，也是限制植物生产力和农业发展的重要因素之一。
为了解决这一问题，对盐胁迫下植物水分平衡调节机制的研究显得尤为重要。
植物对盐胁迫的响应植物在盐胁迫下的响应可以归纳为两类：生理响应和形态响应。
生理响应是指植物在盐胁迫下调整内部环境，维持正常的生理过程，这些过程包括渗透调节、离子调节、抗氧化和调节生长物质的合成等等。
形态响应是指植物在盐胁迫下改变植株外形和结构，减轻盐分影响，这些形态响应包括根系结构调整、叶片改变和数量变化、根系和地上部分的分配比例调整等等。
植物水分平衡调节机制植物水分平衡调节机制是指植物在盐胁迫下调整内部渗透、离子平衡、蒸腾降温等一系列生理过程，以维持正常的生长和发育。
具体来说，包括以下几个方面：1. 细胞渗透调节植物在水分不足的情况下，细胞内水分含量降低，细胞体积缩小，细胞质浓缩，这时渗透压会升高。
通过细胞膜的渗透调节，植物可以保持细胞水分平衡和离子平衡。
在盐胁迫下，植物通过积累不同的有机溶质来调节渗透压，从而维持细胞渗透压平衡。
2. 离子调节盐胁迫会导致土壤中钠、氯、镁等离子积累，从而改变植物细胞内部离子平衡。
植物通过大量积累钾、钙等对植物有益的离子，并减少对盐分吸收，来维持植物细胞内部离子平衡。
3. 蒸腾平衡植物在盐胁迫下，由于水分不足，为了减轻水分流失，植物需要减少蒸腾和增加水分利用效率，从而调节蒸腾平衡。
植物通过关闭气孔、生长新的根系等方式，来有效减少蒸腾流失。
4. 抗氧化盐胁迫下，会导致植物细胞受到氧化应激的影响，从而损害细胞内部结构和功能。
植物通过合成抗氧化物质，如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等，来减轻氧化应激的影响，保护细胞内部结构和功能的完整性。
结语盐胁迫是植物生长中普遍面临的问题，深入研究盐胁迫下植物水分平衡调节机制，可以为植物的抗盐性提高和农业生产做出重要贡献。
细胞程序性死亡的调控机制研究
细胞程序性死亡的调控机制研究在人类身体内，细胞不断地进行着增殖和死亡。
然而，对于一些具有病毒感染或DNA损伤等异常情况的细胞，如果不及时清除，就会对身体造成损害。
为了维护机体内环境的稳定性，我们需要一种能够引导异常细胞自我消亡的机制，这就是细胞程序性死亡（apoptosis）。
细胞程序性死亡是一种高度调控的生物学过程。
当细胞体检测到DNA损伤或者其它的异常状态时，就会激发一个信号通路，从而使得这个细胞开启自毁程序。
这个信号通路中包含了许多的分子，这些分子共同协作完成细胞程序性死亡的任务。
在这个过程中，一些重要的细胞器官如粒细胞和核糖体等也会发生改变。
最早研究细胞程序性死亡的学者是英国的约翰·康妮(Robert Horvitz)和新加坡的霍普金斯(Andrew Fire)。
他们在1993年发现了一些有关线虫-apoptosis的基因，并因此获得了诺贝尔奖。
现在，我们已经知道了很多关于细胞程序性死亡的机制。
我们知道，在不同的生物中，涉及到调控细胞程序性死亡的分子也各不相同。
但是，不管在哪个生物中，一个典型的细胞程序性死亡过程中，大部分都可以分为三个不同的阶段：初始激活、执行程序性死亡命令和细胞坏死。
在初始激活阶段，细胞体内的一些分子将会受到特定的信号刺激。
这些信号会高度特异性地与细胞表面的对应受体结合。
这些受体大多是一些跨膜蛋白，然而，在接受到这些信号的过程中，这些跨膜蛋白会经历一些构象改变，使得它们会在细胞外面活化一些酶，这些酶也被称为半胱氨酸蛋白酶(caspases)。
在第二阶段，这些活化的半胱氨酸蛋白酶将细胞完全销毁。
它们会侵袭细胞的一些重要结构，如蛋白质骨架和核糖体，并摧毁大部分细胞DNA。
随着这些酶的进一步攻击，最终会导致整个细胞溃散成一个由碎片构成的积木状结构，这个过程称为细胞凋亡。
然而，在某些特定情况下，比如细胞受到太大的损害，其程序性死亡会变成一种不可逆的先天的反应，这种现象称为受损性细胞死亡(necrosis)。
盐胁迫诱导水稻根尖细胞程序性死亡过程中的核酸内切酶的开题报告
盐胁迫诱导水稻根尖细胞程序性死亡过程中的核酸内切酶的开题报告一、研究背景和意义水稻是全球最重要的粮食作物之一，在我国的粮食经济中占有重要地位。
然而，因为不断恶化的土地和水资源环境，水稻的生产也受到了很大的影响。
其中，高盐胁迫是导致水稻生长受到限制的重要因素之一。
因此，研究高盐胁迫对水稻生长和发育的影响，对于提高水稻的耐盐性和产量至关重要。
目前已有很多研究表明，盐胁迫对植物的生长和发育都会产生负面影响，并且可能导致植物程序性细胞死亡 (PCD) 的产生。
PCD 是植物内在调节生长和发育的重要过程之一，也是因环境胁迫而导致植物死亡的主要方式之一。
具体来说，PCD 是由于内部或外部胁迫因素导致细胞发生典型的死亡过程，包括核酸内切、细胞壁分解和色素体破坏等现象。
因此，研究盐胁迫诱导水稻根尖细胞程序性死亡的过程，对于加深对水稻耐盐性的认识，提高水稻产量具有十分重要的意义。
二、研究内容和目标本研究将以水稻作为研究对象，构建高盐胁迫处理实验，观察处理后根尖细胞是否产生了程序性死亡现象，并探究其中可能涉及的核酸内切酶的作用。
具体研究内容包括：1. 构建高盐胁迫处理实验。
我们将使用不同浓度的NaCl 溶液来处理水稻幼苗，以获得不同程度的盐胁迫情况下的根尖细胞样本。
2. 观察盐胁迫诱导下的水稻根尖细胞是否发生程序性死亡。
通过细胞形态学方法观察细胞死亡和染色体断裂等现象，验证盐胁迫是否能诱导水稻程序性死亡。
3. 探究核酸内切酶在盐胁迫诱导水稻根尖细胞程序性死亡中的作用。
通过RNAi技术和克隆制备方法来研究内切酶的功能和表达特点，并探究其在程序性死亡调控中的作用。
本研究的主要目标是通过上述实验，从遗传学、细胞生物学等角度深入研究高盐胁迫对水稻根尖细胞程序性死亡的影响，进一步探究相关分子机制，从而为提高水稻的耐盐性和增加产量提供有力的理论支持。
三、研究方法本研究的主要实验方法包括：1. 植物材料处理：使用第一代水稻品种“丰收65”作为研究材料，从种植后的幼苗中挑选处于生长稳定期的样本进行处理。
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目录中文摘要 (1)英文摘要 (3)符号说明 (5)1.引言 (6)1.1 果树水分和盐胁迫研究进展 (6)1.2 植物细胞程序性死亡研究进展 (7)1.3 植物生长发育过程中的PCD (14)1.4 植物细胞内与PCD相关的效应因子 (18)1.5 植物PCD的生物学意义 (22)1.6 本研究的目的和意义 (23)2. 材料与方法 (25)2.1 材料 (25)2.2 试验处理 (25)2.2.1 水分胁迫处理 (24)2.2.2 盐胁迫处理 (25)2.2.3 外源过氧化氢对根系细胞死亡的诱导 (25)2.2.4 线粒体在根细胞死亡过程中的作用 (26)2.2.5 Ca2+对过氧化氢诱导根系死亡的作用 (26)2.3 方法 (26)3. 结果与分析 (31)3.1水分和盐胁迫对平邑甜茶根系活力和活性氧产生的影响 (31)3.2水分和盐胁迫下平邑甜茶根系细胞程序性死亡特征 (33)3.3 外源过氧化氢对平邑甜茶根系PCD的诱导 (36)3.4水分和盐胁迫下平邑甜茶根系线粒体特性变化 (44)3.4.1水分和盐胁迫下根系线粒体H2O2含量变化 (44)3.4.2水分和盐胁迫下根系线粒体膜电位变化 (45)3.4.3 水分和盐胁迫下根系线粒体细胞色素c/a变化 (47)3.5 过氧化氢处理后平邑甜茶根系线粒体特性变化 (48)3.5.1 过氧化氢处理后根系线粒体膜通透性变化 (48)3.5.2过氧化氢处理后根系线粒体膜电位变化 (49)3.5.3 过氧化氢处理后根系线粒体细胞色素c/a测定 (50)3.5.4 过氧化氢处理后根系PCD测定 (51)3.6 钙在过氧化氢诱导根系PCD过程中的作用 (52)3.6.1 钙对根系线粒体中H2O2含量的影响 (52)3.6.2 钙对根系线粒体膜通透性的影响 (53)3.6.3 根系PCD检测 (53)4. 讨论 (56)4.1 细胞程序性死亡与苹果根系对逆境的适应性反应 (56)4.2 活性氧与苹果根系细胞程序性死亡 (57)4.3 苹果根系可检测到caspase活性 (58)4.4逆境胁迫下根系PCD与线粒体的关系 (58)4.5 水分和盐胁迫下根系PCD等反应的异同 (60)4.6 线粒体在过氧化氢诱导根系PCD中的作用 (61)4.7 钙离子在过氧化氢诱导根系PCD中的作用 (63)5. 结论 (65)参考文献 (66)致谢 (84)发表和投寄论文 (85)山东农业大学博士学位论文中文摘要本文以当年生平邑甜茶实生苗为材料，通过20％PEG6000模拟水分胁迫、5‰NaCl 和外源H2O2处理根系，利用琼脂糖凝胶电泳、TUNEL原位末端标记、吖啶橙荧光染色、caspase3/7活性检测和流式细胞仪分析等技术和方法，研究了逆境条件下根系细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）及处理过程中根系线粒体特性的变化及其在根细胞程序性死亡中作用，并且探讨了钙离子对此过程的影响。
结果表明：20％PEG6000和5‰NaCl处理能够诱导平邑甜茶根系发生细胞程序性死亡；水分和盐胁迫下线粒体膜通透性（MPT）增大、膜电位下降（△ϕm）、H2O2含量升高、细胞色素C（cytochrome c, Cyt c）含量下降，这些是导致细胞程序性死亡的重要原因。
利用TUNEL原位检测法证实根细胞中出现了3'-OH末端DNA片段，还检测到根系中caspase3/7的活性在细胞程序性死亡大量发生阶段急剧升高。
在水分和盐胁迫过程中，随着处理时间的延长，MPT不断增大、△ϕm下降、H2O2含量升高、Cyt c含量下降，而且它们的变化紧密联系。
同时观察到，根系线粒体O2˙¯产生速率和H2O2含量的变化在这两种胁迫中存在差异，水分胁迫下二者呈先缓慢升高后快速升高规律变化，而盐胁迫下二者是先下降后快速升高。
外源H2O2能够诱导平邑甜茶根细胞发生程序性死亡，线粒体膜通透性特异性抑制剂降低根系caspase3/7活性和根细胞的凋亡率。
用外源H2O2处理平邑甜茶根系处理20min时MPT和△ϕm均已经发生变化，但此时并没有检测到细胞程序性死亡典型特征出现，而到处理60min时才检测到DNA Ladder和TUNEL阳性反应斑点，用流式细胞仪也检测到细胞凋亡峰。
线粒体膜通透性特异性抑制剂（环孢菌素A）试验显示，环孢菌素A不能够完全抑制MPT的增加、△ϕm的下降、H2O2含量的升高和Cyt c的释放，但能够在一定程度上降低根细胞的凋亡率，这表明在根细胞程序性死亡过程中，线粒体变化是一个早于核苷酸特异性剪切的上游事件，MPT等对根细胞程序性死亡具有重要的调节作用。
水分和盐胁迫通过H2O2诱导根细胞程序性死亡，钙离子参与了H2O2对根细胞程序性死亡的诱导。
与只用H2O2处理的结果相比，低浓度的钙离子（15mmol/L和30mmol/LCaCl2）能够降低MPT和H2O2的含量，而且15mmol/L CaCl2的效果好于30mmol/LCaCl2；高浓度的钙离子（50mmol/LCaCl2）加速了MPT的增加和H2O2含量的升高，钙离子螯合剂EGTA（15mmol/L）和钙调素抑制剂CPZ(10μmol/L)同样对MPT1水分和盐胁迫下平邑甜茶根系细胞程序性死亡研究和H2O2含量的增加具有促进作用，而且CPZ的促进效果高于EGTA，但二者的效果都低于高浓度钙离子的处理。
利用流式细胞仪检测不同钙处理后的根细胞凋亡率，进一步证实了上述结果，即低浓度的钙离子降低了根细胞凋亡率；而高浓度钙离子、EGTA和CPZ则增加了根细胞凋亡率，并且高浓度钙离子处理的凋亡率高于EGTA和CPZ处理。
这些结果表明钙离子对逆境胁迫诱导平邑甜茶根细胞程序性死亡具有复杂的调节作用。
在苹果属植物---平邑甜茶根系中检测到caspase3/7活性，并用吖啶橙荧光染色法检测到植物细胞程序性死亡特征。
caspase3/7是调节动物细胞细胞程序性死亡的关键酶，本研究结果显示苹果属植物中也存在类caspases活性，并能够被水分和盐胁迫所诱导。
吖啶橙染色法主要用于动物细胞程序性死亡检测，在平邑甜茶根PCD检测中，吖啶橙染色法得到的结果与TUNEL原位检测和琼脂糖凝胶电泳法显示的结果一致，表明吖啶橙荧光染色法能够应用于植物实体材料的细胞程序性死亡检测。
关键词：细胞程序性死亡水分胁迫盐胁迫根系线粒体平邑甜茶2山东农业大学博士学位论文AbstractIn order to study plant root PCD(programmed cell death) and effect of mitochondrial changes on plant root PCD under environmental stress, 20% PEG6000, 5‰ NaCl(v/v) and exogenous hydrogen peroxide were used to simulate stress, and the material used in our experiments was one year seedling plant roots of Malus Hupehensis. Agrose electrophoresis, TUNEL(terminal TDT-mediated d-UTP-digoxigenin nick end labeling, TUNEL)method, AO (acridine orange) staining method, caspase3/7 activity determination and FCM (flow cytometry, FCM) technique were used to assay plant root PCD after being treated by 20% PEG6000, 5‰ NaCl and exogenous hydrogen peroxide. And the effect of calcium on the mitochondrial changes and cell death during root PCD was also investigated. The results as follow:In this experiment, the induction of PCD by 20% PEG6000 or 5‰ NaCl-treating was detected in Malus Hupehensis roots, for there had more positive reactions in TUNEL analysis than control indicate that DNA fragmentation with 3’-OH appeared in root cells and caspase3/7 activity increased sharply in the period of root programmed cell death. Further more, mitochondrial permeability transition (MPT) increasing, mitochondrial transmembrane potential(△ϕm) reducing, H2O2 accumulating and cyt c releasing were examined during the process of root cell death, which were important regulators in animal PCD. From the results, we can see that the changes of those regulators in root cell death had relationship with each others. In condition, the difference between 20% PEG treatment and 5‰ NaCl treatment in respect of O2˙¯ production rate and H2O2 accumulation was showed. O2˙¯ production rate and H2O2 accumulation increased in the mode of slowly - quickly during the period of 20% PEG-treating, which in the mode of decreasing – increasing during the time of 5‰ NaCl treating.Exogenous hydrogen peroxide-induced cell death was employed to study mitochondria function involved in Malus Hupehensis root cell death. Both hydrogen peroxide-induced cell death and the increase of MPT were partly blocked by application of MPTP-inhibitor CsA. MPT, cyt c concentration and H2O2 accumulation altered within 20 minutes of exogenous hydrogen peroxide application while there were not accompanied by the3水分和盐胁迫下平邑甜茶根系细胞程序性死亡研究characteristic nuclear morphological changes such as DNA fragmentation because there was not DNA Ladder or apoptotic peak in FCM assay. The positive reaction of TUNEL analysis, DNA Ladder and apoptotic peak in FCM assay were not emerged until hydrogen peroxide-treating in 60 minutes. Those results indicated that MPT increasing, H2O2 accumulating and cyt c releasing were earlier events than nuclear fragmentation, and had regulating function in the process of root PCD.Calcium involved in the process of hydrogen peroxide-induced cell death too. Contracted with the results of hydrogen peroxide treatment, low concentration calcium (15mmol/L Ca2+ and 30mmol/L Ca2+) could decrease MPT and H2O2 accumulation, and the efficiency of 15mmol/L Ca2+ was better than that of 30mmol/L Ca2+; high concentration calcium accelerated MPT increasing and H2O2 accumulating; both Ca2+-chelate EGTA (15mmol/L) and calpaim inhibitor CPZ (10μmol/L) had stimulative effect on MPT increasing and H2O2 accumulating, and the efficiency of CPZ was better than that of EGTA, while the 50mmol/L Ca2+ was the best among them in term of stimulative effect. Apoptotic rate of FCM also proved that low concentration calcium could block cell death partially, while EGTA, CPZ and high concentration calcium enhanced cell death which of apoptotic rate mounted up in turn. In conclusion, the effect of calcium on stress-induced programmed cell death was complex.Caspase3/7 activity was examined in the process of Malus Hupehensis root cell death induced by environment stress, which was a important regulator in animal PCD. The results of AO(acridine orange) staining used in our experiment to assay root PCD was in accordance with that of TUNEL analysis and agrose electrophoresis, which was used frequently in animal PCD examination previously. So it proved that AO staining was suitable for plant PCD examination.Key words: Programmed cell death, water-stress, salt-stress, roots, mitochondria, Malus Hupehensis4符号说明英文缩写英文全称中文名称AO acridine orange 吖啶橙Caspase cys asp-specific protease 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶CPLs caspase-like proteases 类caspase蛋白酶CPZ Chlorpromazine 氯丙嗪CsA cyclosporine A 环孢菌素 A CTAB cetyltriethyammonium bromide 十六烷基三乙基溴化铵DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole hydrochioride 4,6-二咪基二苯基吲哚EB ethidium bromide 溴化乙啶Hoechst 33342, 33258 双苯并咪唑HR hypersensitive response 超敏反应Luminol 鲁米诺PCD programmed cell death 细胞程序性死亡PI propidine iodide 碘化丙啶PVP polyvinylpyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮Rhodamine 123 罗丹明123 ROS reactive oxygen species 活性氧SAR systemic acquired resistance 系统性获得抗性TdT terminal deoxyribonucleotydyl transferase 脱氧核苷酸转移酶TUNEL TdT-mediated-UTP-digoxigenin nick end labeling 原位末端表记1. 引言1.1 果树水分和盐胁迫研究进展众所周知，良好的生态环境是果树赖以生存的条件，对果树生长发育具有极其重要的影响。