黄连上清片微生物检验方法验证方案汇总
黄连上清片微生物限度检查方法适用性试验报告
药品微生物限度检查方法适用性实验报告生产单位：********有限公司检品名称：黄连上清片检品编号：201600479检品批号：20160303试验项目：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法和控制菌检查方法的适用性实验。
试验依据：中国药典2015年版四部1105,1106试验方法：中国药典2015年版四部1105,1106试验要求：1、需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验中，各试验菌试验组菌落减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内。
2、各控制菌检查方法适用性试验中，试验组应检出试验菌。
试验结果：符合规定试验结论：根据方法适用性试验结果，本品微生物限度检查法为：需氧菌总数采用稀释-平皿倾注法（1：50供试液1ml/皿）；霉菌和酵母菌总数计数方法采用平皿倾注法；大肠埃希菌检查法：取1:10供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
沙门菌检查法：取10g，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基中用匀浆仪1档1分混匀。
耐胆盐革兰阴性菌检查法：取1:10供试液1ml加入10ml肠道增菌液体培养基中。
黄连上清片微生物限度检查方法适用性试验检品名称：黄连上清片检品编号：201600479检品批号：20160303生产单位：********有限公司1、方法：1.1检查方法：中国药典2015年版四部1105,11061.2试验方法：中国药典2015年版四部1105,11062、计数方法适用性试验：2.1菌种：金黄色葡萄球菌〈CMCC(B)26 003〉铜绿假单胞菌〈CMCC(B)10 104〉枯草芽孢杆菌〈CMCC(B)63 501〉白色念珠菌〈CMCC(B)98 001〉黑曲霉〈CMCC(B)98 003〉2.2菌液制备：2.2.1取经35℃培养22小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养基培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液，做活菌计数用。
黄连上清片微生物检验方法验证方案概要
黄连上清片微生物限度计数方法适用性验证方案方案编号：VOL-QWX-003方案编号：VOL-QWX-003 版本号：00 第2 页共13页年月验证方案审批表黄连上清片微生物限度计数方法适用性验证方案目录1.概述2.目的3.依据4.范围5.验证小组人员及职责6.验证实施条件7.合格标准8.验证方法9.验证结果10.验证报告1.概述1.1样品资料品名：黄连上清片标准依据：《中国药典》2015版四部通则批号：试验日期：1.2处方：黄连上清片为《中国药典》2015版一部中药成方制剂法定标准。
由黄连、栀子、连翘、炒蔓荆子、防风、荆芥穗、白芷、黄芩、菊花、薄荷、大黄、黄柏、桔梗、川芎、石膏、旋覆花、甘草组成。
辅料为糊精、淀粉、蔗糖、聚维酮K30、微粉硅胶、硬脂酸镁、薄膜包衣粉。
1.3 功能主治：散风清热、泻火止痛。
用于风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结，小便短赤。
1.4 有效期：18个月。
1.5依据《中国药典》2015版四部通则“非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准”，根据剂型与产品处方判断，黄连上清片微生物限度检查内容包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数，控制菌检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌；拟采用“平皿法-培养基稀释法”进行微生物计数方法检查，采用“常规法”进行控制菌检查。
2.目的：确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数和控制菌检查，以确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确性。
若检验程序或产品发生变化，可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
3.依据《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——微生物计数法”《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——控制菌检查法”《中国药典》2015年版四部——“非无菌产品微生物限度标准”4.范围：本验证方案适用于？？制药有限公司黄连上清片微生物限度检查检验方法的适用性试验。
QR-05CP041-03黄连上清片检验原始记录
黄连上清片检验记录一、性状：本品为（糖衣片，除去糖衣后显黄棕色至棕褐色）,气香，味苦。
结论：□符合规定□不符合规定。
二、鉴别：2.1、薄层鉴别：2.1.1、供试品溶液：取本品（10片）片,除去包衣，研细，加甲醇30ml，加热回流分钟，滤过,滤液蒸干，残渣加1%盐酸溶液（25ml) ml，加热回流（1小时），放冷，用乙醚振摇提取2次，每次(20ml) ml，合瓶乙醚液，蒸干，残渣加甲醇(2ml) ml使溶解，作为供试品溶液。
2.1.2、对照药材溶液：取大黄对照药材(0.1g) g，加甲醇(10ml) ml，同法制成对照药材溶液。
2.1.3、对照品溶液：取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml中含(1mg) mg，作为对照品溶液。
2.1.4、点样：照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述三种溶液各(2~4ul) ul，分别点于同一硅胶G薄层板上。
2.1.5、展开：以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。
2.1.6、结果：置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，(显相同顔色的荧光斑点），置氨蒸汽中熏后，斑点变为（红色）。
2.2、薄层鉴别：2.2.1、供试品溶液：取本品（5片）片，除去包衣，加甲醇(10ml) ，超声处理(30分第 1 页共6 页检验人：日期：复核人：日期：钟）分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。
2.2.2、黄连对照药材溶液：取黄连对照药材（0.1g) g，同法制成对照药材溶液。
2.2.3、对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品，甲醇制成每1ml含(0.2mg) mg的溶液，作为对照品溶液。
2.2.4、点样、展开：照薄层色谱法试液，吸取上述三种溶液，各(2ul) ul，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-异丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水（6：1.5：3：1.5：0.3）为展开剂，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开，取出，晾干。
黄连上清片中土大黄苷的检查
黄连上清片中土大黄苷的检查发表时间：2013-03-26T14:27:18.390Z 来源：《医药前沿》2013年第3期供稿作者：丁蓉康红英吴华东[导读] 黄连上清片为临床常用中成药，大黄是其中主要药味之一，且处方量较大，为了保证临床用药的准确。
丁蓉1 康红英2 吴华东2（1三峡大学第一临床医学院/湖北省宜昌市中心人民医院湖北宜昌 443003)(2湖北省宜昌市食品药品检验所湖北宜昌 443005）【摘要】目的：建立黄连上清片中土大黄苷的检查。
方法：采用薄层色谱的方法快速检查样品中是否有土大黄苷，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-水（100:30:2:3）为展开剂，点样量各2ul，置紫外光灯（365nm）下检视。
结果：供试品色谱中，在与土大黄苷对照品色谱相应的位置上不得显相同颜色的的荧光斑点。
结论：该方法快速简便可靠，可用于黄连上清片中是否有土大黄苷的检查。
【关键词】黄连上清片土大黄苷薄层色谱法检查【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）03-0366-02黄连上清片为临床常用中成药，收载于《中国药典》2010年版一部，具有清风清热，泻火止痛的功效。
用于风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结、小便短赤。
处方为十七味中药组成的复方制剂，大黄是其中主要药味之一[1]。
《中国药典》2010年版收载为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎为正品大黄[1]，除上述三种正品大黄外，另有藏边大黄、河套大黄、华北大黄、天山大黄的干燥根和根茎为伪品大黄与正品大黄混淆[2]。
大黄作为常用中药，用量较大，当药源供不应求时，有的厂家用含有土大黄苷伪品大黄代替正品大黄使用。
黄连上清片在药典标准中没有土大黄苷的检查方法，为了保证临床用药的准确、安全和有效，特制定本方法，对处方中使用的大黄是否是用土大黄代替建立了快速薄层鉴别检查方法。
高效液相色谱法在黄连上清片中有效成分的含量测定
高效液相色谱法在黄连上清片中有效成分的含量测定【摘要】目的：建立黄连上清片中大黄素、大黄酚的含量测定方法。
方法：采用高效液相色谱法、色谱柱为Diamonsi C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液测定成分取样量g 样品含量μg加入量μg测得量μg回收率% 平均回收率% RSD%大黄素 0.22760.22560.22680.22810.2286 70.556069.936070.308070.711070.8660 70.650070.650070.650070.650070.6500 140.0905139.1380140.2955140.9370140.5537 99.2198.9799.7099.32 99.35 0.28 大黄酚 0.22760.22560.22680.22810.2286 281.7688 279.2928280.7784282.3878283.0068 280.75 280.75280.75280.75280.75 568.8190 567.0433569.0529570.2333570.6346 101.12 101.25101.34101.22 101.24 0.082.9样品含量测定取不同批号的3份样品，按供试品溶液制备项下的方法制成供试品溶液，按原色谱条件测定大黄素、大黄酚的含量。
结果见表2。
表2 样品含量测定结果测定成分批号含量大黄素 101208101207101106 0.1410.1400.138大黄酚 101208101207101106 0.5650.5580.5613讨论3.1大黄的主要化学成分为大黄素、大黄酚，具有导滞通便，利水通淋，舒肝利胆，泻火解毒，祛瘀消微，止血，止吐，止痛等功效。
为了更好控制药品的质量，本文采用高效液相色谱法测定制剂中大黄素、大黄酚的含量。
3.2参照《中国药典》2010年版一部大黄素、大黄酚在254nm处有较好的吸收度。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。
4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。
4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。
基于微生物检定法的黄连_黄连上清丸质量标准的研究
药品生物制品检定所提供; 黄 连对照药材 ( 批号: 小抑菌浓度 ( M IC )和最小杀菌浓度 ( MBC ), 结果黄
120913- 200407) , 中国药品生物制品检定所提供; 连水煎 液 对上 述 五 种标 准 菌 株的 M IC 依 次 为:
黄连 (批号 07004、07005、07006) 原药材 ( 四川产;
1. 2. 1 实验菌的筛选 取黄连对照药材, 加 10 / 8
盐酸小檗碱 能否控制黄连质 量, 尚存在 争议。为 倍量的水煎煮二次, 第一次 2 h, 第二次 1. 5 h, 过
此, 我们参照西药中有效成分不明或没有适宜理化 滤, 合 并 滤液, 减压 浓 缩 制成 1g /mL 的 水煎 液。
方法鉴别的药物使用生物检定法为其质控方法的
2 ( pH = 7. 0 )
抗生素 ∀ 号培养基
无圈 圈小, 边缘模糊不清并且双圈
抗生素 #号培养基
圈小, 边缘呈毛边 圈小, 边缘轻微毛边
3 ( pH = 7. 8 )
圈大小合适, 边缘模糊不清
圈大小合适, 边缘清晰
由上表 2可以看出采用缓冲液为 pH = 7. 8, 抗生素 #号培养基时黄连药材的抑菌圈大小合适, 边缘 清楚, 便 于测量。所以 选用缓冲液为 pH = 7. 8, 抗 生素
和反应效应呈线性关系 , 且相关性好 ( r= 0. 9912); 生物检定法和 H PLC 法作为质控 指标得出质 量评价结果 基本 相同。结论 采用微生物检定法建立黄连、黄连上清丸的质量控制方法是可 行的、合理的。它可 以有效配合 传统 检验方法对黄连药材进 行质量监控。
关键词: 黄连; 黄连上清丸; 生物检定法
1
800. 00
清热解毒类中成药微生物限度检查方法验证
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黄连上清片微生物限度计数方法适用性
验证方案
方案编号：VOL-QWX-003
方案编号：VOL-QWX-003 版本号：00 第2 页共13页
年月
验证方案审批表
黄连上清片微生物限度计数方法适用性
验证方案目录
1.概述
2.目的
3.依据
4.范围
5.验证小组人员及职责
6.验证实施条件
7.合格标准
8.验证方法
9.验证结果
10.验证报告
1.概述
1.1样品资料
品名：黄连上清片标准依据：《中国药典》2015版四部通则
批号：试验日期：
1.2处方：黄连上清片为《中国药典》2015版一部中药成方制剂法定标准。
由黄连、栀子、连翘、炒蔓荆子、防风、荆芥穗、白芷、黄芩、菊花、薄荷、大黄、黄柏、桔梗、川芎、石膏、旋覆花、甘草组成。
辅料为糊精、淀粉、蔗糖、聚维酮K30、微粉硅胶、硬脂酸镁、薄膜包衣粉。
1.3 功能主治：散风清热、泻火止痛。
用于风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结，小便短赤。
1.4 有效期：18个月。
1.5依据《中国药典》2015版四部通则“非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准”，根据剂型与产品处方判断，黄连上清片微生物限度检查内容包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数，控制菌检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌；拟采用“平皿法-培养基稀释法”进行微生物计数方法检查，采用“常规法”进行控制菌检查。
2.目的：确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数和控制菌检查，以确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确性。
若检验程序或产品发生变化，可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
3.依据
《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——微生物计数法”
《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——控制菌检查法”
《中国药典》2015年版四部——“非无菌产品微生物限度标准”
4.范围：本验证方案适用于？？制药有限公司黄连上清片微生物限度检查检验方法的适用性试验。
6. 验证实施条件
6.1 检验用水：公司制备的经检验合格的纯化水。
6.2检验仪器设备：验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，经过确认或再确认后合格。
所用检验设备如下：
SPX-250型生化培养箱
PYX-DHS-400型隔水式电热恒温培养箱
101-2型电热鼓风干燥箱
DHP-9272型恒温培养箱
DHP-9032型恒温培养箱
YX-400型医用双层普型不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器
DSX-280KB24 立升手提式压力蒸汽灭菌器
GSP-9080型隔水式电热恒温培养箱
6.3 验证培养基：验证所使用的培养基经过培养基的适用性检查，结果符合药典要求。
6.4 验证菌株：
7. 合格标准
7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.2在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌，阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组不得检出试验菌。
8. 验证方法
8.1 菌液制备
所有使用的菌株均为西林瓶包装的定量菌株。
定量菌株适用于培养基适用性检查、控制菌检查、促生长试验、灵敏度检查等。
使用前将金黄色葡萄球菌株西林瓶、枯草芽孢杆菌株西林瓶、白色念珠菌株西林瓶、铜绿假单胞菌菌株、黑曲霉菌株西林瓶从冰箱中拿出平衡至室温，加入含有11ml无菌生理盐水的试管中，盖上瓶盖，静置约30s，震荡10s，吸取1ml加至适宜培养基中培养，即得含量为10～100cfu的菌落。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
8.2 菌液的检验
8.2.1取上述金黄色葡萄球菌株、枯草芽孢杆菌株、大肠埃希菌菌株、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌菌株的稀释液各1ml，分别用45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml
注皿，各平行测定两皿，30℃～35℃培养5天，计数，应为10～100cfu/ml，结果见表1。
8.2.2取上述白色念珠菌菌株、黑曲霉菌株的稀释液各1ml，分别用45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，20℃～25℃培养7天，计数，应为10～100cfu/ml，结果见表1。
8.3需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性试验
供试液制备：取供试品10g，加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成供试液，作为1：10的供试液。
8.3.1平皿法：结果见表2～8.
8.3.1.1试验组：取供试液分别按1ml/皿加入平皿后，加入上述10～100cfu的试验菌，立即倾注至《中国药典》2015版规定的琼脂培养基中，置规定的温度培养3～5天，观察结果。
8.3.1.2菌液组：除不加供试液外，同试验组测定方法。
8.3.1.3供试品对照组：除不加菌液外，同试验组测定方法。
8.3.1.4将以上平皿需氧菌置30～35℃培养不超过5天，霉菌、酵母菌置20～25℃培养不超过7天，并在5天和7天分别进行计数。
8.3.1.5回收比值的计算：
试验组的菌落数—供试品对照组菌落数
—————————————————————————
菌液对照组菌落数
8.3.2培养基稀释法：结果见表2～8。
8.3.2.1实验组：取供试液分别按0.5ml/皿、0.2ml/皿加入平皿后，加入上述50～100cfu 的试验菌，立即倾注2015版药典规定的琼脂培养基，置规定的温度培养3～5天，观察结果。
8.3.2.2菌液组：除不加供试液外，同试验组测定方法。
8.3.2.3供试品对照组：除不加菌液外，同试验组测定方法。
8.3.2.4将以上平皿需氧菌置30～35℃培养不超过5天，霉菌、酵母菌置20～25℃培养不超过7天，并在5天和7天分别进行计数。
8.3.2.5回收比值的计算：
试验组的菌落数—供试品对照组菌落数
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菌液对照组菌落数
8.4 控制菌检查方法适用性试验
8.4.1大肠埃希菌
供试液制备：同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验”供试液制备。
8.4.1.1试验组：取供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入上述大肠埃希菌10～100cfu菌液，置30℃～35℃培养24小时后，取培养物1ml接种至100ml 麦康凯液体培养基中，42℃～44℃培养24～48小时后，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。
8.4.1.2阴性对照组：以等体积的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，除不加菌液外，其他操作同试验组。
8.4.1.3阳性对照组：以等体积的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，其他操作同试验组。
8.4.1.4供试品对照组：取供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，除不加菌液外，其他操作同试验组。
8.4.1.5实验结果：见表9。
8.4.2耐胆盐革兰阴性菌
供试液制备：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml，制成1：10的供试液在20℃～25℃培养2小时。
8.4.2.1定性试验试验组：取上述供试液10ml，加置100ml肠道菌增菌液体培养基中，同时加入上述大肠埃希菌50～100cfu的试验菌，30℃～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30℃～35℃培养18～24小时，观察结果。
其它实验菌株同法操作。
8.4.2.2阴性对照组：以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，除不加菌液外，其他操作同试验组。
8.4.2.3阳性对照组：以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，其他操作同试验组。
8.4.2.4供试品对照组：取供试液10ml加入100ml肠道菌增菌液体培养基中，除不加菌液外，其他操作同试验组。
8.4.2.5同定性试验法做相当于0.1g、0.01g、0.001g的供试品定量试验。
若定性试验中，未检出耐胆盐革兰氏阴性菌，则不需要再进行定量试验。
8.4.2.6实验结果：见表9。
8.4.3沙门菌
供试液制备：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml,混匀，30℃～35℃培养18～24小时。
8.4.3.1试验组：取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，同时加入上述乙型副伤寒沙门菌50～100cfu的试验菌，30～350C培养24h后；取少量RV 沙门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～350C 培养48h后，观察结果。
其它实验菌株同法操作。
8.4.3.2阴性对照组：以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，除不加菌液外，其他操作同试验组。
8.4.3.3阳性对照组：以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液，其他操作同试验组。
8.4.3.4供试品对照组：取供试品10g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml，混匀，
除不加菌液外，其他操作同试验组。
8.4.3.5实验结果：见表9～10。
9.验证结果
表5、铜绿假单胞菌计数方法的验证（菌落计数单位：cfu，胰酪大豆胨琼脂培养基）
注：表中“+”表示试验结果检出控制菌；“-”表示试验结果未检出控制菌。
10.验证总结报告
验证总结报告。