qPCR引物设计原则及具体操作步骤
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程一、①实验前准备,每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用.取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75％乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1＊PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；(管盖与管壁都需标记样品名称)2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3—5min;（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次）(不应用振荡器混匀），室温静置10min;5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4℃下，14，000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清;6）用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP 管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qpcr引物设计原则和注意事项
qpcr引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计是指为了检测特定基因序列而设计的一种引物，是实现qPCR技术的关键技术之一。
引物设计的准确性和准确性直接影响qPCR的精确性、可靠性和重复性。
qPCR引物设计的原则是：1）选择被检测序列的5’端两个核苷酸作为引物的开始；2）采用20-23bp的长度，保证引物的灵敏度和特异性；3）引物的Tm值应位于55-60°C，以确保引物有足够的结合力；4）尽量避免引物中存在重复序列；5）尽量避免引物中存在非特异性结合位点。
在设计qPCR引物时，应注意以下几点：1）选择被检测基因序列的特定位置作为引物的起始位点；2）计算引物的Tm值，以确保引物的结合力；3）避免引物中存在重复序列及其它非特异性结合位点；4）加入引物的标记磷酸，以增加引物的特异性；5）检查引物序列中是否存在致突变的核苷酸；6）检查引物序列中是否存在非特异性结合位点。
总之，qPCR引物设计是一项重要且复杂的技术，设计者必须特别注意以上原则和注意事项，以确保设计出的引物具有足够的特异性和灵敏度，以实现qPCR的准确性和可靠性。
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。
引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。
因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。
步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。
这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。
确定目标序列后，我们可以继续设计引物。
步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。
这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。
引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。
过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。
GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。
在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。
Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。
Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。
引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。
步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。
此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。
步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。
这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。
特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。
10.26-qPCR引物设计
10.26-qPCR引物设计设计原则：1.PCR扩增产物长度 :80-150bp. 引物的产物⼤⼩不要太⼤，⼀般在80-250bp之间都可；80-150bp最为合适（可以延长⾄300 bp）2.引物长度⼀般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常⽤的是18-27bp，但不应⼤于38bp，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进⾏反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
Tm=58-60度。
GC含量（composition）过⾼或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太⼤。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡的解链温度，即在⼀定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，⼀般⾼于Tm值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很⼤的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，⽽当末位链为T时，错配的引发效率⼤⼤降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
5.引物⾃⾝及引物之间不应存在互补序列。
引物⾃⾝不应存在互补序列，否则引物⾃⾝会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本⾝复性。
这种⼆级结构会因空间位阻⽽影响引物与模板的复性结合。
引物⾃⾝不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防⽌引物⼆聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物⼆聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过⾼（应⼩于4.5kcal/mol）。
否则易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使反应不能正常进⾏。
sybr green qpcr引物设计原则
sybr green qpcr引物设计原则实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种高通量检测技术，用于快速准确的检测和定量化DNA。
它的成功离不开准确的引物设计。
SYBR Green qPCR引物设计原则是一种指导性的设计方法，可用于指导研究人员开发有效的qPCR探针引物。
SYBR Green qPCR引物设计原则主要包括：（1）引物结合特异性：引物在qPCR反应中用于特异性结合DNA 模板，以引起聚合反应。
因此，研究人员应密切关注引物体系中两个特异性配对序列（3’端Tm值> 55℃）的准确性，以及引物在不同条件下能够结合DNA模板的特异性。
（2）引物安全性：引物的设计应避免在qPCR反应过程中与目标DNA片段发生不特异性结合，或者它们之间的交叉反应也应该尽可能地被避免。
（3）引物的Tm值：Tm值是指底物在指定温度下（通常在60℃至70℃），一半的引物分子与目标片段结合的温度，这是产生指定特异性酶催化活性的关键因素。
（4）引物体系的GC含量：该体系应控制在30%-70%之间，以消除组成成分对反应条件的影响。
（5）引物长度：通常，qPCR引物呈放射形式排列，其反应条件最为理想。
同时，引物长度应尽可能降低，以降低反应成本，提高反应的效率。
一般情况下，引物的长度为17-24bp，3’端的长度应不小于17bp，5’端的长度可以小于17bp，最好尽量控制在20bp左右。
（6）引物的单体纯度：反应受到低纯度引物影响会变慢，结果不可靠，因此引物的纯度应高于95％。
（7）灵敏性：灵敏性是指qPCR反应可以检测到的最低DNA模板浓度。
灵敏性越高，实验的结果越准确，一般来说，灵敏度达到1ng/ul 或更高水平。
（8）模板效应：模板效应是指反应影响模板浓度的引物反应比。
当t>Ct的情况出现，这是由于引物失效或模板效应，其中模板效应是由引物/模板量比变化引起的。
此外，在引物设计策略中，还应特别注意一些重要参数，如引物杂交温度（Tm）、安全性、灵敏度等，以及产品的单体纯度、杂质团规格等。
qpcr的操作流程
qpcr的操作流程
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、准确的分子生物学技朧，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。
下面将介绍qPCR的操作流程。
1. 样品处理：首先需要从样品中提取RNA或DNA，并进行适当
的纯化处理。
确保提取的核酸质量和浓度符合实验要求。
2. 质控检测：对提取的核酸进行质控检测，包括测定纯度、浓
度和完整性。
确保核酸的质量符合实验要求。
3. 反转录：对RNA进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。
反
转录反应需要使用逆转录酶和引物，确保反转录产物的质量和完整性。
4. 准备qPCR反应体系：根据实验设计和引物设计，准备qPCR
反应体系。
包括模板DNA或cDNA、引物、探针、核酸酶、缓冲液等。
确保反应体系的配比准确。
5. 进行qPCR反应：将准备好的反应体系加入到qPCR仪器中，
进行PCR扩增反应。
根据实验设计和引物特性，设置合适的PCR程
序和参数。
6. 数据分析：分析qPCR反应的数据，包括计算Ct值、绘制标
准曲线、计算目标基因的相对表达量等。
确保数据的准确性和可靠性。
7. 结果解读：根据数据分析结果，解读实验结果。
判断目标基因的表达水平、基因型等信息，为后续实验和研究提供参考。
总的来说，qPCR操作流程包括样品处理、质控检测、反转录、准备反应体系、进行PCR反应、数据分析和结果解读等步骤。
通过严格的实验设计和操作规范，可以获得准确、可靠的实验结果，为分子生物学研究提供重要的数据支持。
使用Oligo设计QPCR引物—以果蝇LaminC序列为例
使用Oligo设计QPCR引物—以果蝇LaminC序列为例普通PCR的基础上，加上荧光信号，在扩增目的片段的过程中通过荧光信号的富集来得到Ct值，从而确定基因转录表达含量。
[1]引物设计原则[1]考虑引物与DNA片段结合的特异性、强度以及是否会产生引物二聚体等因素，因此有如下原则：◆引物长度大于16bp，18～24个核苷酸；◆引物与靶序列间的Tm值不应该过低。
两条引物之间尽量接近，差值不超过4℃；◆引物不应该有发夹结构，不能有4bp以上回文序列；◆两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基；◆碱基尽可能均匀分布，GC含量在40～60%；◆引物尽量不形成二级结构。
◆但是qPCR与其他PCR的扩增目的稍微有所不同，qPCR需要通过快速扩增实现对转录本的定量。
因此一般要求扩增的片段比较短，一般在200bp以下，考虑是否会引物特异性高低问题出现杂峰等。
扩增长度，建议在100~300bp 间比较好扩增；引物长度在20~25bp 较好，而且上下游引物间不要相差超过5bp；再就是看看Tm 值，60℃左右，相差不要超过1℃。
●引物长度一般为15-27 bp，最适为18-22 bp（注意此处所指的长度是结合到模板的长度，不包括5'端加修饰后的长度），过长会导致延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
上下游引物长度差不超过4 bp，Tm差不超过2℃。
●引物序列在模板其他位置应当没有相似性较高的序列，尤其是3'端，否则容易导致错配。
引物3'端避免出现3个以上的连续碱基如GGG或CCC。
●引物3'端的末位碱基对Taq酶合成效率有较大影响，末位碱基为A的错配率明显高于其他碱基，应当避免在引物的3'端使用碱基A。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5'端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
QPCR详细实验过程和仪器操作说明
QPCR详细实验过程和仪器操作说明QPCR（定量聚合酶链反应）是一种用于快速、准确测定DNA或RNA样品中特定序列的浓度的方法。
本文将详细介绍QPCR的实验过程和仪器操作步骤。
实验过程：1.样品准备：将待测DNA或RNA样品提取并纯化。
确保样品的质量和浓度适合QPCR分析。
2.引物设计：设计引物和探针，确保其在目标序列上具有特异性，并且没有多余的副产物。
3.校准曲线：准备一系列已知浓度的标准曲线样品，用于生成标准曲线。
标准曲线通常包含5-6个标准浓度点。
4.反应体系配制：根据实验需要，准备反应体系。
常见的反应体系包括引物、模板DNA或RNA、聚合酶、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和缓冲液。
仪器操作说明：1.准备反应管：在无菌条件下，将QPCR反应混合物分配到每个反应管中。
确保每个反应管中的混合物组成相同，并尽量避免气泡的产生。
2.反应管密封：使用盖板密封每个反应管，确保反应过程中的蒸发和污染最小化。
3.进入PCR机：将每个反应管放入热循环仪（PCR机）中，并按照下列程序设置反应条件：- 热活化（Hot start）：将样品加热至95℃，通常持续2-10分钟，以破坏可能存在的非特异性扩增产物。
-反应循环：将样品依次加热至目标温度（通常为94-98℃）进行DNA的解离，然后降温至引物结合温度进行引物结合和扩增。
通常需要25-40个循环。
-结束延伸：在最后一个循环结束时，将样品加热至72℃进行延伸，以确保所有引物的扩增完成。
-终止反应：在所有反应循环结束后，通常会将样品保持在4℃，防止扩增产物的退化。
4.数据分析：使用专门的软件对QPCR数据进行分析，包括计算阈值周期数（Ct值）、计算目标序列的相对表达量等。
QPCR是一种非常精确和灵敏的方法，但在操作过程中应注意以下几点：-使用无菌操作，以避免样品污染。
-严格控制反应条件和时间，确保反应的重复性和准确性。
-正确安装和使用PCR机以确保温度的准确控制，并避免样品间的交叉污染。
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qPCR引物设计原则及具体操作步骤
1.找基因（DNA）
1)通过英文名称查找
通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称
→进入NCBI官网
→点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面
→在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可
2)通过序列号查找
通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。
例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。
3)通过引物查找
通过查找文献，找到别人用过的对应的引物
→在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST
→输入正、反向引物序列
→设置对应参数
→点击“Get Primers”进行搜索即可
4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存
序列。
2.qPCR引物和TaqMan探针的设计
1)引物设计注意事项
a)引物长度17bp-25bp为佳。
太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出
现引物高级结构的几率增加。
两者都会干扰定量结果的准确性
b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180）
c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距
不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算；
d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其
是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。
e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。
f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能
搭上
g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的
GC互搭
h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C
i)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间
j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域
k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种
l)需跨外显子设计，避免基因组污染
2)TaqMan探针设计指南
a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个
碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。
b)应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。
c)探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存
在淬灭作用
d)3’端应避免使用碱基A
e)如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。
f)保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配
对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A因为A、T为双键，而G、A为三键。
g)探针长度：Taqman探针的长度最好在25-32bp之间（一般为18-40bp），且Tm值在68-
72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃（至少要5℃），这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。
GC含量在40%-70%。
3)利用软件Primer Premier 5进行设计
打开软件，点击File→New→DNA Sequence→复制粘贴基因序列→点击Primer
→点击Search→设置对应参数（可调整）→点击OK
移动位置等），直至筛选出最优的正、反向引物。
在Primer-BLAST网页左上边框粘贴基因序列，设置相应参数，点击网页左下角的“Get
Primers”进行搜索即可。
（方便直接看到引物可能扩增的其他物种序列）
3.质量鉴定
1)利用软件PrimerSelect对引物和探针进行评估
打开软件PrimerSelect（在软件DNASTAR里面可以找到）→新建日志
→输入要进行比对的引物和探针序列→选择要比对的序列→点击Report即可输出相应的比对数据
（因为部分序列已经在Primer Premier 5比对过了，所以只要在此处比对正向探针和反向引物，或者反向探针和正向引物即可）
3’端尽量不要搭上
2)利用Primer-BLAST查看引物可能扩增的序列（重要！）
在Primer-BLAST网页输入设计好的正、反向引物序列→点击“Get Primers”进行搜索即可（若不止出现目的病毒序列，还出现了检测物种身上的其他病毒序列，则引物需要重新
设计）
4.引物和探针的合成
1)设计合成基因序列所需的引物
（若需要检测多个病毒，合成阳性模板，可将需要检测的病毒的扩增序列拼接在一起，最
好不超过500bp）
百度搜索DNAWorks，进入基因合成的网站
→填写名称（必须包含大写字母、小写字母和数字，不能加横杆或其他字符）
→填写网易邮箱
→选择相应的物种（做真核表达时需尤其注意，其他可根据需要进行选择）
→设置相应的参数
→粘贴需要合成的基因序列→点击“Design Oligos”，等待邮件（一般几分钟即可收到）
→打开收到的邮件，查看引物评分，评分尽量保证在“5”以下，越趋近于“0”越好
→复制粘贴引物序列，送往引物合成公司进行合成即可
2)合成引物
a)普通PCR引物用脱盐纯DSL即可
b)qPCP引物用PAGE纯，探针用HPLC纯
c)探针5’端荧光基团选择顺序“FAM→HEX→ROX, CY5”，3’端猝灭基团选择顺序“BHQ
→TAMRA→Eclipse”。