猪瘟抗体检测
非洲猪瘟病原学检测方法
非洲猪瘟病原学检测方法介绍非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种高致病性的猪病，对于猪养殖业来说是一种严重威胁。
为了及时有效地进行疫情监测和病原学分析，科学家们发展了多种非洲猪瘟病原学检测方法。
本文将对这些检测方法进行详细的探讨。
PCR方法传统PCR1.样品收集：从患病猪只的脾脏、淋巴结或血液中收集样品。
2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒将样品中的DNA提取出来。
3.PCR反应体系：设置PCR反应体系，其中包括引物、模板DNA、酶和缓冲液。
4.PCR扩增程序：设定PCR扩增程序，包括一系列不同温度的循环反应。
5.结果分析：利用凝胶电泳的方法，观察PCR产物的大小。
实时定量PCR1.样品收集和DNA提取：与传统PCR相同。
2.PCR反应体系：与传统PCR相同，但引入了荧光探针。
3.实时定量PCR程序：设定实时定量PCR程序，包括多个不同温度的循环反应。
4.数据分析：根据荧光信号的强度和阈值周期数，计算出病毒数量。
优点•灵敏度高：PCR方法能够检测到非洲猪瘟病原体的极低浓度。
•特异性强：引物的设计使得PCR方法能够区分非洲猪瘟病原体和其他相关病原体。
•快速性：PCR方法可以在短时间内得到结果。
缺点•对实验操作要求高：PCR方法需要精确计量样品和试剂。
•易受污染：PCR方法容易受到外部环境中目标DNA的污染。
•不适合现场应用：PCR方法的设备和试剂有一定的成本，不适合一些资源有限的地区。
ELISA方法直接ELISA1.样品准备：从患病猪只的血液中收集样品。
2.酶标板涂层：将非洲猪瘟病毒的抗原涂在酶标板上。
3.样品加入：将已稀释的血清样品加入到酶标板中。
4.洗涤步骤：用洗涤缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的抗体。
5.反应步骤：加入与非洲猪瘟病毒抗体标记的酶联二抗。
6.洗涤步骤：洗涤酶标板，去除未结合的酶联二抗。
7.显示步骤：加入底物，使酶与底物反应产生可见的颜色。
8.终止反应：加入终止液停止酶的反应。
猪瘟抗体的几种常用检测方法概述
养猪 Ｓ ＷＩ Ｎ Ｅ Ｐ Ｒ Ｏ Ｄ Ｕ Ｃ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ（ ６ ）
２ ０ １ ３
猪 瘟 抗 体 的 几 种 常 用 检 测 方 法 概 述
李 娇 ， 王金 良ｔ ， 一 ， 沈志强 ，
（ １ ． 山东绿都 生物科技有限公司， 山东 滨州
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ２ ８ ５ ． ３ 文献标志码 ： Ａ
Ｅ — ｍａ ｉ ｈ ｌ ｉ ｊ ｉ ａ ｏ ＿ ｚ ｏ ｎ ｅ ＠１ ６ ３ ． ｔ ｏ ｍ
猪瘟疫苗 的首免 日龄 ， 为免疫程序 的制定提 供 了参 考依据嘲 。付少刚等采用 Ｉ Ｈ Ａ方法调 查 ２ ０ ０ ５ —２ Ｏ １ Ｏ 年银川市猪瘟疫苗 的免疫合格率 ，共采集 ２ ４ ３ ６份 免疫猪血清样品，检测结果显示 ， ２ ０ ０ ５ 年 免疫合格 率为 ４ ２ ％、 ２ ０ ０ ６年 免疫合 格率 为 ５ １ ． ５ ％、 ２ ０ ０ ７年 免 疫合格率 为 ６ ３ ． ４ ％、 ２ ０ ０ ８年 免 疫 合 格 率 为 ８ １ ％、 ２ ０ ０ ９年 免 疫合 格率 为 ８ ７ ％、 ２ ０ １ ０年 免疫 合格 率 为 ９ ０ ％，提 出 Ｉ Ｈ Ａ方法 可 实现对 猪瘟 抗体 水平 的监 测， 明确猪 瘟抗 体合格 率变化 特 点 ， 探 寻猪瘟 的发 生动态和流 行规律 ， 为指导和 制定猪瘟 防控措施提 供参考嘲 。Ｉ Ｈ Ａ方法操 作简单 、 检 测快速 、 无 需仪器 设备 ， 可作为猪瘟抗体检测 的一种方法 。但 Ｉ Ｈ Ａ检 测方法使用全病 毒作为抗原 ， 全 病毒抗 原制备过程 繁琐 、 受病 毒纯 化方 面的 限制 ， 纯化 效果较 差则试 验 的稳 定性和重复性均较差 ； 且检测 的血清样 品需 经过灭活 处理 ，血清 的质量 严重影 响检 测结果 ， 同 时存 在 肉眼判读 、 误 差大等 缺 点， 不适 合需 要准确 检测猪瘟 抗体水平 的流行病 学调查 ， 但 一般养殖场 及广 大养殖 户 可根据对 检测 结果 准确程 度 的实 际 需要选择应用 。 ２ 中和试 验 中和试验是将猪瘟病毒准 确定量 后 ，加 不同稀 释度 的被检血清，通过测定被检血清阻止病毒感染 培养细胞的能力而测定其抗体效价 。因猪瘟病毒在 细胞培养 中不产生细胞病 变， 故 需借助标记抗体 （ 如 荧光标记） 来检测抗原抗 体反应 的信号 （ 荧光抗体染 色检 查有无 荧光斑 的出现） 。李素等应 用 中和试 验 方法对 ６头仔猪猪瘟疫苗 免疫前后 的血清抗体进行 检测表 明， 中和试验方法检 测结果确 实、 特异， 能真 实 反映免疫猪群 的猪瘟抗 体水平 。中和试 验方法 涉及 细胞培养和显微镜观察 ， 故对试验 仪器 、 操作人
非洲猪瘟的抗体检测
血清处理或保存不当（储存或 运输不当），如溶血样品可能会产 生高达20％的假阳性结果。因此， 通过ELISA检测的所有阳性和可疑 样品必须通过其他血清学替代试验 确认。
IB技术是用于蛋白质检测和鉴定 的快速、灵敏的检测技术。IB技术的 原理是抗原抗体的特异性结合。IB技 术中使用了覆盖有病毒抗原的纸条， 首先是抗原溶解、电泳分离以及转移 到薄膜上（通常是硝化纤维素膜）， 之后与特异性一抗反应，再与标记二 抗作用后，产生可直接观察的阳性反 应条带（见图1）。
ELISA是一种常用的检测技术， 广泛用于多种动物疫病的大规模血 清学调查。该方法的显著特点是灵 敏度高、特异性好、速度快、成本 低，结果清晰。借助于自动化设备 的使用，可以实现大量样品的快速 筛选。
ELISA使用标记物检测血清样品 中的ASF抗体。ELISA使用的标记通 常是某种酶。当抗原和抗体彼此结合 时，酶引起底物发生颜色变化，从而 鉴定ASF阳性样品。目前，多种用于 ASF抗体检测的间接或阻断ELISA已 实现商品化供应，或者由实验室“自 主”建立。
阳性样品在感染细胞的细胞质中显示特异性荧光
◎图2 间接荧光抗体（IFA）对ASF抗体的检测
73
非洲猪瘟防控专栏 African swine fever prevention and control column
☆中国畜牧业
进行确认。 二、间接荧光抗体试验(IFA)对
非洲猪瘟抗体的检测 该技术的原理是用具有细胞适
综上所述，目前可用的诊断 技术可通过综合病毒和抗体检测 来确诊ASF。实时荧光PCR是最广
阳性样品在感染细胞的细胞质中显示特异性红色染色结果
◎图3 间接免疫氧化物酶试验（IPT）对ASF抗体的检测
泛应用的病毒学诊断技术，可敏 感、特异、快速地实现ASFV核酸 的检测。
非洲猪瘟的实验室检测技术与质量控制
非洲猪瘟的实验室检测技术与质量控制非洲猪瘟是一种高度传染性的猪病，对猪养殖业造成了巨大的经济损失。
为了及早发现和控制非洲猪瘟的传播，实验室检测技术和质量控制在疾病监测和病毒鉴定中起着至关重要的作用。
本文将重点介绍非洲猪瘟的实验室检测技术，并探讨质量控制在检测中的重要性。
一、实验室检测技术1. PCR技术聚合酶链反应（PCR）是非洲猪瘟病毒检测中最常用的技术之一。
它能够从动物组织或血液样本中快速检出病毒的核酸。
PCR技术具有高灵敏度和高特异性，可以在感染初期就进行检测。
此外，PCR技术还可以区分非洲猪瘟病毒与其他相关病毒的差异，提高了检测的准确性。
2. ELISA技术酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种常用的检测非洲猪瘟病毒抗体的技术。
ELISA技术通过检测动物血清中的特定抗体水平来确定是否有非洲猪瘟病毒感染。
ELISA技术具有高效、准确、简便的特点，并可以进行大量样本的快速筛查。
3. 病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定是为确定病原体是否存在以及其类型、亚型和基因组序列等信息提供关键数据的技术。
通过将实验室动物感染或组织样本接种到适当的细胞培养物中，可以成功分离非洲猪瘟病毒。
然后，通过电镜观察和核酸测序等方法，可以鉴定病毒的特征和亚型。
二、质量控制在非洲猪瘟实验室检测中，质量控制起着至关重要的作用，可以保证检测结果的准确性和可靠性。
以下是一些常用的质量控制措施：1. 内部质控实验室应建立内部质控计划，包括使用已知标准样本进行日常质控，以确保实验的稳定性和准确性。
这些标准样本应包括阳性对照、阴性对照和质量控制样本，用于验证实验室的操作流程和仪器设备的性能。
2. 外部质控参与外部质控项目有助于实验室评估其检测结果的准确性和可靠性。
外部质控项目由国家或国际组织组织，实验室需按要求参加，接受其他实验室的盲样品检测，并比对结果评估自身实验室的准确性。
3. 人员培训和认证实验室工作人员需要进行相关培训，包括病毒检测技术的理论和实践，操作规范以及质量控制流程。
猪瘟抗体检测不合格的原因分析
１ 疫 苗 因素
个别 猪场使用的猪瘟疫苗中可能未含有足够量 的有活力的抗原 ， 其本身 的保护性能差 ， 影响了免疫 效果。疫苗毒 （ 菌） 株与田间流行毒 （ 菌） 株血清型
个规模养猪场各采集血样 ｌ ０ 份进行猪瘟抗体检测 。 大多数猪场的猪瘟抗体检测合格率均可达到 ８ ５ ％以 上 ，而个别猪场的猪瘟抗体检测结果则未达到规定 的标准 。笔者结合实际情况 ， 将其原 因总结如下。
有较高的母源抗体或前次免疫残 留的抗体 ，对疫苗 产生了免疫干扰。接种时动物已处于潜伏感染 ， 或在
或 亚 型不 一 致 ， 或 流行 株 的血 清型 发 生 了变 化 ， 或 疫
３ 人为 因素
免 疫 接种 工作 不 规 范 。如肌 注 免疫 时 出 现 “ 飞
苗选择不当甚 至于用错疫苗 。疫苗运输、 保管不当， 或疫苗稀释后未及时使用 ， 造成疫苗失效或减效 ， 或 使用 过 期 、变质 的疫 苗 。不 同类 疫 苗 之 间 的干 扰 作
经 常消毒 ， 对 仔猪要加强调教 ， 加强护理 ， 平 时注意 观察 ， 及时发现病猪 ， 及时隔离治疗 ， 防止传播蔓延 。
春季节 ， 在 猪多拥挤 ， 圈舍潮湿 ， 保温差等饲养 管理
４ 治 疗
“ 除癞灵”（ 主要成分为辛硫磷 ）按说 明涂抹 ， 先用洁净 的温水洗净患部 ， 把竹筷劈开 ， 然后轻轻刮 去硬皮 ， 再涂抹 。Ｏ ． ５ ％～ １ ． Ｏ ％的 “ 敌百虫”（ 邻氨基苯
兽 药
猪 瘟 抗 体 检 测 不 合 格 的 原 因 分 析
耿 松 王兆 亮 （ 江苏省沛县畜牧兽医站 ２ ２ １ ６ ０ ０ ）
猪瘟抗体检测
猪瘟病毒IgG抗体检测ELISA试剂盒使用说明书
【产品简介】
猪瘟病毒（CSFV）是目前危害国内养猪业一种高发病率、高死亡率和高度接触传染的病毒。
在猪的免疫预防工作中,最值得关注的就是强化免疫的接种时机问题。
在过高的抗体水平进行免疫,过高的抗体水平还会中和疫苗,影响疫苗的免疫效果,导致免疫失败；在较低的抗体水平进行免疫,又会出现抗体保护真空期,威胁猪的健康。
该试剂盒检测反映抗体水平，利于指导免疫时机。
【使用时间】
①猪瘟病毒疫苗免疫后免疫效果监测
②平时的抗体监测
【检测原理】
包被经纯化的猪瘟病毒，抗猪IgG抗体作为酶标记抗体，利用间接法来检测被检材料中是否含有猪瘟病毒抗体。
【产品内容】
7. 剩余样品及废弃物应经121℃高压蒸汽灭菌30分钟，或用5.0g/L次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。
【保存与有效期】
于2～8℃避光保存，有效期自成品检定合格之日起为12个月。
4种猪瘟病毒抗体检测方法的比较
4种猪瘟病毒抗体检测方法的比较马超英【摘要】为比较4种猪瘟病毒抗体检测方法的优缺点,应用正向间接血凝试验(IHA),间接ELISA、Dot-ELISA、胶体金免疫层析试纸条(GICA)4种方法分别对142份猪血清样品进行检测.结果表明,间接ELISA方法检出阳性样品119份,IHA检出阳性样品117份,Dot-ELISA检出阳性样品115份,GICA检出阳性样品109份.结果提示,在对猪瘟病毒抗体进行检测时,间接ELISA由于其灵敏性高,可作为首选检测方法,但操作时需要避免假阳性的出现；正向间接血凝试验虽然灵敏度稍低,对血清质量要求高,但结果准确,是猪瘟抗体检测必不可少的检测方法,适合个体检测；胶体金试纸条和dot-ELISA检测时间较短、操作简单、无需特殊仪器设配,由于受其敏感性较低所限,适合对畜群进行检测.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)010【总页数】4页(P128-131)【关键词】猪瘟抗体;检测方法;优缺点【作者】马超英【作者单位】青海省海西州乌兰县铜普兽医站,青海乌兰817000【正文语种】中文【中图分类】S852.651猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上主要以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征［1］。
猪瘟具有高度传染性，主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和病死率高，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国也将其列为一类动物疫病，是严重危害我国养猪业的最重要的疫病之一［2－6］。
近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，转变为隐性感染和亚病毒感染，在临床表现上也更加复杂，既有区域性流行，又有零星散发，既有高病死率的急性症状，又有持续感染的温和性症状趋于复杂化，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，在病理剖检上也常常不同于典型猪瘟的病理变化，给兽医临床诊断带来了很大困难［7］。
猪瘟抗体检测方法
猪瘟抗体检测方法猪瘟，即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪瘟病毒引起的一种严重的传染病，对猪群健康和养殖业产生了重大影响。
为了及时控制疫情和保护养殖业的发展，猪瘟抗体检测方法非常重要。
猪瘟抗体检测方法主要包括传统血清学法和分子生物学法。
传统血清学法主要是利用抗原-抗体反应原理进行检测，分子生物学法则是通过检测猪瘟病毒核酸进行诊断。
下面我将详细介绍这两种方法。
传统血清学法中最常用的方法是血清病毒中和试验。
该方法通过将待检血清与猪瘟病毒进行反应，观察病毒和抗体的相互作用。
这种方法的优点是简单、经济、可靠，适用于大规模的抗体检测。
但是存在一些局限性，如需要对待测血清和病毒进行配对，病毒株的选择和制备需要一定的经验和技术，且过程较为繁琐。
另一种传统血清学方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）。
该方法利用特异性的酶标记抗体来检测待测血清中的猪瘟病毒抗体。
ELISA具有操作简单、灵敏度高、多重样品同时检测等优势。
此外，还可以通过改变试剂盒中抗原的性质，进一步检测不同类型的抗体，如IgM和IgG。
但是，该方法需要进行酶标仪等专门设备的检测，成本较高。
分子生物学法主要是通过检测猪瘟病毒核酸来进行诊断。
常用的方法包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）。
PCR是一种高度敏感且特异的检测方法，通过扩增待检样品中的病毒核酸，可以快速检测出病毒的存在。
RT-qPCR则能实时监测PCR反应的过程，具有更高的精确性和灵敏度。
此外，PCR还可以进行基因测序，用于病毒株的分型和溯源研究。
然而，分子生物学法虽然灵敏度高，但仍存在一些局限性。
首先，该方法对设备和技术要求较高，需要专业的实验室和操作人员。
其次，由于病毒基因组的变异性较大，需要选择合适的引物和探针，以确保检测的准确性。
此外，病毒核酸在环境中的稳定性较差，易受到污染和降解的影响，可能导致假阴性结果。
综上所述，猪瘟抗体检测方法在疫情监测、疫苗评估和动物检疫等方面具有重要作用。
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温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度） 等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结 合的合适温度。
2、ELISA操作要点
严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器 是保证ELISA必要条件。 严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
五、注意事项
1、基本操作注意事项
加样:
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加样本，加酶结
合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部
，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
1、基本操作注意事项
保温:
抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(或孵育
incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面 上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？
1、基本操作注意事项
洗涤:
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着 实验的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的 干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的 ，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤 下来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免 疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗 体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗 涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中 的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过 反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中 受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底 物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分 析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的 结果，使测定方法达到很高的敏感度。
猪瘟抗体ELISA检测
2015年12月
提 纲
1
ELSA基础知识 猪瘟抗体检测ELISA原理 实验前准备
2 3
4
5
操作过程
注意事项
一、ELISA概念及类型
50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫 （RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来 标记抗原或抗体的分析技术 1971年此项技术由瑞典学者 Engvall 和Perlmann， 荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道，将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定 方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA）
三、实验前准备
常用仪器
洗涤液配置：浓缩洗 涤液用蒸馏水或去离 子水25倍稀释。 用CSFV样品稀释液 20倍稀释待检样品 使用前所有试剂盒组 分应恢复到18-26℃， 并震荡混匀。
四、猪瘟ELISA操作过程
1、移板：在CSF 抗原包被板上加入 各100vl阴、阳性 对照，阴阳性对照 设复空。在相应空 中加入100vl已稀 释好的样品，封板 37℃温育30min。
在ELISA方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” （conjugate）； （3）酶反应的底物。
几种常用的ELISA检测方法
双抗体夹心法测抗原（常用） 夹心法 双抗原夹心法测抗体 间接法测抗体（常用） 竞争法测抗原 竞争法 竞争法测抗体 捕获包被法测抗体 亲和素-生物素 ELISA法
二、猪瘟抗体检测ELISA实验原理
☆ 包被板上包被的猪瘟(CSF)抗原，可与待测样品中
的特异性抗体（抗-CSFV）反应，形成抗原抗体复 合物被吸附到固相上，再加入酶标记的抗猪IgG， 形成“固相猪瘟病毒抗原-猪瘟病毒抗体-抗猪IgGHRP”免疫复合物，洗涤后，如待测样品中含有猪 瘟抗体，加入显色液即显色，为阳性；反之为阴性。
边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规 定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显
色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无
色。
1、基本操作注意事项
酶标仪:
酶标比色仪简称酶标仪，主要性能指标有：测读速 度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性 等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确 性为±1%，重复性达0.5%。 操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。测读值时，要选用产物的敏感 吸收峰，如本实验用450nm波长。有的酶标仪可用双波 长式测读。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明 书。
6、每孔加入50vl 终止液，终止 反应。 7、测量并记录样 品和对照的OD 值（450nm）
结果分析
1、实验成立条件 阴性对照值=（NC1+NC2）/2 阳性对照值=（PC1+PC2）/2 实验成立条件：阳性对照平均值-阴性对照平均值≥0.1，阴 性对照平均值≤0.1。 2、结果判定 样品计算 S/P=(样品-阴性对照平均值）/（阳性对照平均值 -阴性对照平均值） S/P值＜0.4,样品判定为CSFV抗体阳性。 S/P值＞0.4,样品判定为CSFV抗体阴性。
2、洗板，弃去各空液 体，280vl/孔已稀释 洗涤液洗涤板空， 共洗5次，每次洗涤 后弃孔内液，最后 一次将板空洗涤液 拍干。 3、加酶结合物，每孔 100vl，封板37℃温 育30min。
4、重复步骤2洗板。 5、每孔加入50vl显 色A液和50vl显色 B液（也可A、B 显色液等比例混 合后加入100vl）， 封板37℃温育 10min。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
1、基本操作注意事项
显色:
显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应
。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间
内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈 色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，