免疫细胞化学常用试剂分解
免疫组织化学实验流程
免疫组织化学实验流程免疫组织化学实验是一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过标记的抗体来定位抗原的生物学技术。
以下是免疫组织化学实验的基本流程：一、实验准备组织样本处理：获取的组织样本需要经过固定、脱水、透明和浸蜡等处理步骤，以便于切片和后续的免疫组织化学实验。
抗体选择：根据实验目的选择相应的抗体，确保抗体的特异性高、亲和力强，并且与抗原的结合效果好。
实验试剂准备：准备好免疫组织化学实验所需的抗体、二抗、底物、DAB染色剂等试剂，确保试剂的质量和有效性。
二、切片制作将经过处理的组织样本切成薄片，厚度一般为3-5微米。
将切片放置在载玻片上，用滤纸吸去多余的蜡滴。
在切片上滴加适量的抗体，使其与抗原充分结合。
三、免疫组织化学染色在切片上加入适量的二抗，与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。
加入底物溶液，使其与抗原-抗体复合物反应，生成有色产物。
用DAB染色剂对有色产物进行染色，使其呈现明显的颜色。
四、观察与记录在显微镜下观察染色结果，根据抗原的分布和染色强度进行记录。
可以使用图像分析系统对染色结果进行定量分析，进一步了解抗原的表达情况。
五、结果分析根据染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况，与正常组织进行比较，判断其与疾病的关系。
将结果与其他实验室指标相结合，进行综合分析，为临床诊断和治疗提供依据。
需要注意的是，免疫组织化学实验的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、抗原的特异性、组织处理的方法等。
因此，在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，对于结果的解读需要结合临床背景和实验室其他指标进行综合分析，避免出现误判或漏诊的情况。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
免疫细胞化学(coverslip)
免疫细胞化学（Coverslip）1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。
）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。
）3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。
）以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：4.封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。
）5.孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。
（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。
）6.用TBST洗2次， 10min/次；7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。
）8.用TBST洗2次，5min/次。
（如抗体的非特异多也可多洗。
）9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。
10.封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载玻片上。
（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组织化学(SP)
免疫组织化学（SP）一、烤片：60℃，1h；二、脱蜡：二甲苯I、II、III各15min；三、水化：100%I、II酒精各10min，95%、90%、80%、70%梯度酒精各5min，再蒸馏水清洗1min；四、修复：将切片浸入0.01M 枸橼酸缓冲液，以微波炉最大火力（98-100℃）加热至沸腾，再将微波炉调至修复档加热约5min（塑料切片架），让后将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；五、灭活：SP试剂盒中的3%过氧化氢，在室温下灭活30min，PBS洗涤3次，每次5min；六、封闭：用山羊血清封闭（即A液），室温封闭30min，倾去多余血清，勿洗涤；七、一抗孵育：分别加入一抗（兔抗IL-6多克隆抗体，1:3000稀释）4℃过夜，第二天取出后室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；八、二抗孵育：滴加SP试剂盒中的二抗（即B液），室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；九、滴加SP试剂盒中的辣根标记工作液（即C液），室温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；十、DAB显色：配制DAB显色液（DAB浓缩液一滴+底物液1ml），滴加DAB后计时（约1min），保持染色时间一致，在显微镜下观察（即指标变色，背景不变），用蒸馏水终止反应；十一、核复染：苏木素染核5min，自来水漂洗4-5次，1%盐酸酒精分化数秒，自来水中反蓝20min，蒸馏水漂洗3次，每次5min；十二、脱水：梯度酒精70%、80%、90%、95%酒精各5min，100%I、100%II酒精各10min，37℃温箱烤干；十三、透明：二甲苯I、II、III各2min；注意：冰冻切片不需要烤片、脱蜡、水化；直接将切片固定：甲醇，3min，震荡；再清洗：蒸馏水，5min，3次，震荡；即可进行修复及之后的实验步骤。
免疫细胞化学常用试剂
免疫细胞化学常用试剂一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
免疫组织化学的一般步骤
免疫组织化学是一种用于研究组织中特定抗原或蛋白质表达的方法。
下面是免疫组织化学的一般步骤：
取材和固定：从感兴趣的组织或细胞中取材，常用方法包括活体组织切片或细胞培养。
然后将取得的样本进行固定，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
抗原解露：将固定的样本进行抗原解露处理，以增强目标抗原的可见性。
常用的解露方法包括热解露、酶解露和抗原修复等。
阻断非特异性结合：在进行免疫染色前，需要使用适当的阻断剂或血清来阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果的产生。
抗体染色：将适当的一抗（特异性抗体）加入样本中，与目标抗原结合形成免疫复合物。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
通常会在该步骤中进行洗涤，以去除未结合的抗体。
二抗染色：添加与一抗宿主动物种类不同的二抗（标记有特定染色剂的抗体），使其与一抗结合。
二抗的标记剂可以是酶、荧光染料或金颗粒等，用于可视化免疫反应结果。
可视化：根据标记剂的性质，采用相应的方法对免疫反应结果进行可视化。
例如，使用底物来检测酶标记的二抗，或者直接观察荧光染料的发光信号。
染色和显微观察：在免疫反应完成后，可以对样本进行染色以增强对组织结构的观察。
最后，在显微镜下观察和记录结果。
免疫组化-1
免疫组织化学技术概述免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。
Immunohistochemistry1.概念采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。
实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
2．发展简史☐1941年Coons 首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
——建立免疫荧光技术。
☐60年代Nakane铁蛋白标记Ab,用酶代替荧光素来标记抗体的方法——建立酶标抗体技术。
☐70年代Stemberger 改良上述技术——建立辣根过氧化物酶-抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
当今使用最为广泛☐1975年建立单克隆抗体技术。
☐80年代Hsu 等建立了抗生物素-生物素（ABC）法之后，免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
☐90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展☐2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。
凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。
用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。
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免疫细胞化学常用试剂一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸 150mlKarasson-Schwlt’s PB至1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）试剂：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB 至1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）试剂：对苯醌 4.0g0．01mol/L PBS 1 000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。
此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB 500ml0.01mol/L PBS 500mlTris 约14g浓HCl 少许ECD 10g25%戊二醛 3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS 漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解，应在用前几天配制。
（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。
此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
（2）1% OsO4-PB：试剂：A、2.26% NaH2PO4·2H2O 4.15mlB2.52% 8.5mlC、5.4% 葡萄糖5mlD、OsO4 0.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。
但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。
总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。
目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s 液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamb oni’s液等混合固定液。
二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。