3、引物和探针设计
基因探针设计方法
基因探针设计方法引言：基因探针是一种用于检测、鉴定和定量基因组中特定序列的工具。
基因探针设计方法是指在设计基因探针时所采用的一系列策略和技术。
本文将介绍几种常见的基因探针设计方法。
一、序列比对法序列比对法是一种常见的基因探针设计方法。
该方法首先通过比对已知基因组中的目标序列和待测样本中的序列，找出两者之间的相同和差异。
然后，根据差异的部分设计探针，以便在待测样本中检测目标序列的存在。
二、引物法引物法是一种常用的基因探针设计方法。
该方法通过设计一对引物，其中一个引物与目标序列的前端相互配对，另一个引物与目标序列的后端相互配对。
然后，在PCR反应中使用这对引物来扩增目标序列。
通过引物的设计和优化，可以提高扩增的特异性和效率。
三、杂交法杂交法是一种常见的基因探针设计方法。
该方法基于DNA或RNA 的互补配对原理，设计一条探针序列与目标序列互补配对。
当待测样本中存在目标序列时，探针与目标序列发生杂交。
通过检测杂交信号的强度或位置，可以判断目标序列的存在与否。
四、测序法测序法是一种高精度的基因探针设计方法。
该方法通过对待测样本进行DNA或RNA测序，获得样本中的所有序列信息。
然后，根据需要设计探针，以便在测序结果中检测目标序列的存在。
测序法能够提供更为准确和全面的信息，但相对来说成本较高。
五、基因芯片法基因芯片法是一种高通量的基因探针设计方法。
该方法通过将大量的基因探针固定在芯片上，然后将待测样本与芯片上的基因探针进行杂交。
通过检测杂交信号的强度或位置，可以判断待测样本中基因的表达水平或存在与否。
六、机器学习法机器学习法是一种基于人工智能的基因探针设计方法。
该方法通过训练计算机模型，使其能够从大量的基因组数据中学习，并根据学习结果设计探针。
机器学习法能够充分利用大数据的优势，提高基因探针设计的准确性和效率。
七、优化算法法优化算法法是一种基于数学优化理论的基因探针设计方法。
该方法通过建立数学模型，并使用优化算法来求解最优解。
引物探针设计简介
引物探针设计简介已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。
所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。
一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。
计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。
通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。
因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。
2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
特异性是指发生错误引发的频率。
特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。
如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。
引物和探针设计
引物和探针设计 –PCR 和定量PCR基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录1247基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3'-羟基由相配的引物提供。
引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。
这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。
在延长过程中，RNA 引物降解并由DNA取代。
体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。
通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。
对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP)1引物设计的重要因素2有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。
它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。
最流行的软件为Primer 3，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。
典型的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。
非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。
应避免编码单一序列和重复序列的引物。
引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。
应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。
最常用的解链温度计算公式显示如下。
“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。
引物探针验证的实验方法
引物探针验证的实验方法在分子生物学领域，引物探针验证是一种常用的实验方法，用于检测目标DNA序列的存在与数量。
本文将详细介绍引物探针验证的实验方法，包括实验原理、实验步骤、注意事项等方面，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、实验原理引物探针验证实验基于聚合酶链式反应（PCR）技术，通过设计特定的引物和探针，使目标DNA序列在PCR过程中特异性扩增，并通过探针检测扩增产物，从而实现对目标序列的定量分析。
二、实验步骤1.设计引物和探针：根据目标DNA序列，设计特异性引物和探针。
引物长度一般为20-25个核苷酸，探针长度一般为15-25个核苷酸。
2.提取模板DNA：从待测样本中提取DNA，作为PCR反应的模板。
3.配制PCR反应体系：根据实验需求，配制含有引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的PCR反应体系。
4.PCR扩增：将PCR反应体系放入PCR仪中，进行以下循环扩增：- 94℃预变性5分钟；- 94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30-40个循环；- 72℃延伸5分钟。
5.分析PCR产物：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的大小和亮度，初步判断实验结果。
6.探针检测：将PCR产物与标记有荧光的探针进行杂交反应，通过荧光检测仪分析荧光信号，实现对目标序列的定量分析。
三、注意事项1.引物和探针设计：确保引物和探针的特异性，避免非特异性扩增。
2.模板DNA提取：保证模板DNA的质量和浓度，以获得可靠的实验结果。
3.PCR反应体系：根据实验需求，调整各试剂的浓度和比例。
4.PCR扩增：严格控制PCR反应条件，避免扩增过程中的污染。
5.结果分析：结合琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，综合判断实验结果。
四、实验总结引物探针验证实验是一种准确、高效的分子生物学检测方法。
通过掌握实验原理和步骤，严格遵循注意事项，可以获得可靠的实验结果。
探针设计的原则是什么？
探针设计的原则是什么？
1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
2. 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
3. 扩增长度应不超过400bp，理想的扩增长度在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
4. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
5. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G （不能有4个连续的G）。
6. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
在原理上与引物设计是比较类似的。
只是因为探针序列要求匹配度很高，所以对于探针的GC含量和Tm值都是有严格要求的，而且还要考虑到与上下游引物相匹配。
假如你手头已经有了染料法的引物，然后想仍然使用这一对引物、在这一对引物对应的序列中间选一段作为探针可以吗？我们不建议这么做。
因为你单独设计的上下游引物没问题，单独设计的探针看起来也没问题，但把引物与探针放在一起，就有可能出现参数不兼容的问题。
所以还是三者放在一起设计才好。
引物探针区别_国际标准_解释说明以及概述
引物探针区别国际标准解释说明以及概述1. 引言1.1 概述引物和探针在生物学和分子生物学研究中起着至关重要的作用。
它们是使用特定序列来检测或扩增DNA或RNA分子的小片段。
通常情况下，引物和探针被设计成与目标DNA或RNA序列互补。
1.2 文章结构本文将详细介绍引物和探针的定义及其作用，并对它们之间的区别进行阐述。
同时，我们还将解释国际标准对于引物和探针的规范并对相关条款进行说明。
最后，我们将总结引物和探针的区别以及它们在不同应用场景中的作用，并提出对国际标准的评价与建议。
1.3 目的本文旨在帮助读者更好地理解引物和探针的概念、作用以及它们之间的区别。
此外，通过解释国际标准对于引物和探针的规范要求，了解如何正确地设计和使用这些分子工具。
通过阐明引物和探针在科学研究中的重要性，可以提高读者对于这些技术应用的认识水平，并为进一步开展相关研究提供基础知识。
2. 引物和探针的定义及作用2.1 引物的含义和作用引物是指在DNA分子复制、扩增以及序列测定等实验中，用于特异性识别并结合到目标DNA序列上的短链寡核苷酸。
引物通常由20-30个碱基组成，其序列应与目标DNA序列互补或部分互补，在实验过程中起到引导扩增反应、选择性检测目标序列等作用。
引物在聚合酶链反应（PCR）中起特异性识别某一目标基因片段的作用，通过与目标DNA序列互补配对形成稳定的引物-模板复合体，为DNA聚合酶提供一个起始点进行扩增。
引物的设计需要考虑多个因素，包括GC含量、长度、配对形式和温度等参数，以确保引物能够高效地结合目标序列而不与其他非特异性序列杂交。
2.2 探针的含义和作用探针是指在基因组学研究、荧光原位杂交等实验中使用的一类带有特定报告信号（如荧光染料或放射性同位素）的核酸分子。
探针通常由20-30个碱基组成，可以与目标DNA或RNA序列特异性结合，并通过检测信号来定位和识别目标序列。
探针的设计需要依据具体实验需求确定，可以是荧光探针、原位杂交探针、Northern分析中使用的RNA探针等。
定量PCR引物探针设计原则
定量P C R引物探针设计原则TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】定量P C R引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar 等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
2017第九章 PCR引物及杂交探针设计
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miRBase : /
miRNA引物设计 主讲教师：赵雨杰
由于miRNA序列较短； 由于miRNA存在成熟和颈环序列； 用实时定量PCR检测生物样品中某种miRNA含量 引物设计是比较特殊的； 首先，需完成miRNA逆转录；然后，进行扩增。
2、茎环状结构的RT引物 （ABI产品为主）
由可以自身呈环茎状的特异序列＋6到8个miRNA3’端 反向互补碱基组成。(一条miRNA序列特异对应一个 茎环状结构的RT引物）。另外一条引物3‘端含有6-8 个目标miRNA5'端碱基序列，再加一段随机序列，以 确保引物的Tm值在60℃左右。
美国signosis公司的一种新方法
1. 引物应用模板核酸序列保守区内设计并具有特异性。 2. 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段，产物不能形成二级结构。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。
5. 碱基要随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 6. 引物自身不能有连续4个碱基以上的互补。 7. 引物之间不能有连续4个碱基以上的互补。 8. 引物5′端可以修饰。 9. 引物3′端不可修饰。
pcr扩增时taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步
PCR引物及杂交探针设计
3. 分子信标:是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的 发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补 配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。 PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定 DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
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12
Questions?
13
• 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G
• C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链 • 多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基
6
基因表达探针
R
TaqMan探针
Q 3'
Exon 1
Exon 2
Exon 3
基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性
8
TaqMan MGB探针
(non-fluorescent quencher) NFQ
R AGGCCTTGAGAGATAT
Q
MGB
Q
(minor groove binder)
提高探针Tm值 R Q AGGCCTTGAGAGATAT
| | | | | | | | | | ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ | | | | |
GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
• 引物3’端的5个碱基中，G和C加起来不要超过2个
• 引物3’端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基 • 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对 • 避免引物自身形成环状发卡结构 • 扩增片段的长度在50-150bp之间
11
检查引物特异性
• NCBI BLAST引物扩增特异性 /Blast.cgi
淬灭荧光
报告荧光 报告荧光 参比荧光
TEXAS Red
CY-5
~610
~670
报告荧光
报告荧光
10
引物设计
• 引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠 • 引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间 • 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G • 引物Tm值在58-60C之间，上下游引物Tm不要超过2C
7
基因分型探针
polymorphism
DO NOT PLACE HERE
NN N N N N N N N N N N N N N N N N N
Try to position the polymorphism here (central third)
If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)
Module 3: 引物探针的设计流程
The world leader in serving science 1
引物探针的设计流程
选择目标基因 / SNP位点
设计探针和引物
筛选引物、探针，优化各组分浓度
验证
完成
2
选择目的基因/SNP位点
3
序列查找
4
设计探针引物
5
探针设计原则
• 优先考虑探针位置 • 探针的5'端第一个碱基不能是G • 基因表达探针Tm值：68-70C；基因分型探针Tm值：65-67C • TaqMan探针长度13-30bp，TaqMan-MGB探针长度在13-25bp
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
9
荧光标记基团选择
荧光染料
6-FAM SYBR Green I JOE VIC
最大发射峰 (nm)
~520 ~520 ~550 ~550
用途
报告荧光 报告荧光 报告荧光 报告荧光
TAMRA
NED CY-3 ROX
~580
~580 ~580 ~610