两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则
Taqman探针设计要领
如何设计荧光定量PCR实验方案 如何设计荧光定量PCR实验方案 PCR
根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方 法，选择荧光素的种类 合成引物和探针 收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反 复冻融 ） 制备标准品（质粒、化学合成的目的基因）
拷贝数=质量÷分子量×6.0×1023 标准曲线通常由4～5个点组成
定量—— 定量 绝对标准曲 线方法
标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好 分装后保存于-80℃ 荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBR Green I 不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量 应用于定量病毒荷载量等
定量—— 定量 相对 标准曲 线方法 指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用
配制好的引物和探针，保存于-20℃，注意避光 保存探针 RT反应
如何设计荧光定量PCR实验Байду номын сангаас 如何设计荧光定量PCR实验方 PCR 案
不加探针的常规PCR反应，验证引物是否 合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。 同时确定最佳反应体系和反应条件 每次实验都设置阴性对照和标准品，每个 样品设两个平行孔
• 引物和探针的设计原则的重要程度由上 往下越来越低 • 如果是设计SYBR Green I引物，也要选 择TaqMan Primer and Probe design并 遵守这些规则，但是只需要合成引物就 可以了。 • 为了确保引物和探针的特异性，最好将 设计好的序列在 www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次， 如果发现由非特异性互补区，建议重新 设计引物探针。
一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得 到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同 内对照基因的比值作为定量的最后结果
荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
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荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
2011-05-17 08:41
什么是TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料？荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。
TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
SYBR荧光染料：在传统PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，这样就保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
当PCR循环复制时DNA双链也成倍增长，同样SYBR 染料的荧光的信号也随之增倍，通过实时监测整个PCR进程中荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
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精品。
Q-PCR讲解
确认反应特异性，增加数据可信度
qPCR的数学原理
• 理想的PCR反应： Xn=X0×2n • 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n • 方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
得到少量基因（数目）的
信息
根据试验情况进行选择
概述 样品准备
• qPCR技术 • 绝对定量VS相对定量 • 一步法VS两步法 qRT-PCR • 核酸提取 • cDNA 合成(两步法 qRT-PCR) • 引物设计方法和原则 •必要的对照、内参、标准 •选择相应的荧光检测方法 •试剂选择 •分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线 •实验常见问题分析
相对定量方法
– 基因表达差异 – 目的基因，内参基因
• ∆∆Ct
– – – – – – – – – – 只依靠Ct值 用于大通量（很多基因，如芯片结果） 计算简单 估计性的结果 要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好 结果精确 对扩增效率要求不高 构建目的基因与内参基因的标准品 相当于两个绝对定量 每次反应都要作标准曲线
• BLAST（ /）
结构特异性
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SYBR引物设计原则
SYBR-Green引物
引物长度18-30 bps，产物长度范围100~400bp
G/C 含量: 40-60% 避免引物内含有互补序列 (尤其是3’端) 避免3’ 端错配 3’端不能出现连续三个以上的G或C
实验设计
数据分析
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核酸提取
RNA 提取
• • • • • TransZol TransZol Plant EasyPure Viral DNA/RNA Kit EasyPure Blood RNA Kit EasyPure miRNA Kit TransZol Up EasyPure RNA Kit EasyPure Plant RNA Kit TransZol Up Plus RNA Kit
realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价
real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2．探针长度Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
EHP、SHIV 双重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法的构建及应用
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：本研究根据GenBank 中已有的虾肝肠胞虫（EHP ）和虾血细胞虹彩病毒（SHIV ）基因的保守序列，设计特异的引物和探针。
建立了快速诊断EHP 和SHIV 的双重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法，并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。
结果表明：该方法检测限可达10 copies/μL ，其敏感性是SYBR Green real-time PCR 的10倍，普通PCR 法的100倍；对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌，以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性，表明无交叉反应，具有良好特异性；重复性试验结果表明，该方法Ct 值的变异系数小于4%，具有良好的稳定性。
对37份已知检测结果的样品进行检测，结果符合率为100%。
本研究建立的EHP 和SHIV 检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点，适用于对虾隐性感染的早期监测。
关键词：虾肝肠胞虫；虾血细胞虹彩病毒；TaqMan 荧光定量PCR 中图分类号： S852.723文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2022）01-0112-08Development of a Duplex TaqMan Real-time PCR Assay for Detection of EnterocyTozoon Hepatopenaei and Shrimp Hemocyte IridovirusHOUYuee 1, ZENG Junxia 1, LAN Jianyuan 1, XU Zaozhu 1, LIAO Xiuyun 2, LUO Baozheng 2(1. Zhuhai Kerric T esting T echnolongy Co. Ltd., Zhuhai 519000, China; 2. Gongbei Customs district technology center, Zhuhai 519015, China)收稿日期：2019-09-04基金项目：珠海市公共技术服务平台产学研协同创新计划项目（IETP201901011）作者简介：侯月娥，女，硕士,主要从事畜禽和水产疾病及免疫防治通信作者：罗宝正，E-mail：*************EHP 、SHIV 双重TaqMan 实时荧光定量PCR检测方法的构建及应用侯月娥1，曾俊霞1，蓝间媛1，许枣珠1，廖秀云2，罗宝正2（1.珠海科艺普检测科技有限公司，珠海51900；2.拱北海关技术中心，珠海519015）2022,30(1): 112-119Abstract: In this study, specific probes and primers were designed according to Enterocy Tozoon Hepatopenaei (EHP) and Shrimp Hemocyte Iridovirus (SHIV) gene sequences in GenBank. A d uplex TaqMan-based real-time quantitative PCR assay was then developed by optimizing the reaction conditions. The results demonstrated that this PCR assay was more sensitive for EHP and SHIV with the detection limit of 1×10 copies/μL, which was 10-fold higher than SYBR Green real-time PCR and 100-fold higher than conventional PCR. Specifi city tests showed no cross reactions with White spot syndrome virus, Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, High pathogenicity ibrio parahaemolyticus and Taura syndrome virus. Repeatability tests demonstrated that the threshold cycle of the method gave a good stability with the coeffi cient of variations were less than 4%. Then 37 samples were tested by using a duplex TaqMan real-time PCR and conventional PCR and the results reached 100% agreement. In conclusion, the duplex TaqMan-based real-time quantitative PCR assay developed here were specifi c and sensitive for rapid detection of EHP and SHIV . Therefore, it could be suitable for early duplex TaqMan-based real-time quantitative PCR assay of latent infection of shrimp.Key words: Enterocy tozoon hepatopenaei; shrimp hemocyte iridovirus; TaqMan real-time PCR; detection· 113 ·侯月娥等：EHP、SHIV 双重TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法的构建及应用第30卷第1期虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）是2009年于泰国养殖池塘生长迟缓的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现的专门寄生于细胞内的原生生物[1-2]。
定量PCR Taqman探针设计要领
定量PCR+Taqman探针设计要领自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR 荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA 或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DN***段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
定量PCR引物探针设计原则完整版
定量P C R引物探针设计原则Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR 要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。
建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。
引物设计原则
PCR引物设计的黄金法则2006-8-22 15:46:001.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
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两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则
遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。
期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。
定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化
荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保
证回归系数大于0.99。
CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
C(t) value
扩增曲线阈值及CT值
荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应：
X=X0*2n
非理想的PCR反应：
X=X0* (1+Ex)n
（n：扩增反应的循环次数；X：第n次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex：扩增效率）在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)
XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M
方程式(1)两边同时取对数得:
log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)
整理方程式(2)得:
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)
由此可见，log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。
Sample
利用相对定量的方法分析目的基因的表达
研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。
基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA 反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了
品初始浓度不同而造成的差异。
所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。
因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时
期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。
常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta Ct法。
一、双标准曲线法
所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。
公式如下：
双标准曲线法的特点：
1、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误
差；
2、思路直观、条理清晰、应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优
化；
3、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；
4、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。
二、2 -△△CT法
公式如下：
1、2 - △△CT 方法的推导
PCR 指数扩增的公式是：
Xn 是第n 个循环后目标分子数；X 0 是初始目标分子数；Ex 是目标分子扩增效率；n 是循环数；C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数
因此：
X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数；C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数；Kx 是一个常数；对于内参反应而言，也有同样的公式：
用X T 除以R T 得到：
对于使用Taqman 探针的实时扩增而言，X T 和R T 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。
因此常数K 并不一定等于1 。
假设目标序列与内参序列扩增效率相同：
或：
X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△C T 表示目标基因和内标基因C T 值的差异（C T,X -C T,R ）
整理上式得：
最后用任一样本q 的X N 除以参照因子（calibrator ，cb ）的X N 得到：
在这里
对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。
因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：
2、方法的假设和应用
要使△△C T 计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等或相差小于0.1。
2 -△△CT法的特点：
1、由Delta-delta Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同
时默认两个基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。
2、用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和
看家基因做两组标准曲线。
看两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。
反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。
此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
3、当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而
只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
4、这种方法对于样品量少，但研究的基因数目较多的实验特别有用，因为一旦条件优化好
之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。