PNA探针设计规则---北京思尔成生物
初中生物学_遗传部分_概念探针研究_高明英
摘要采用文献法，研究了初中遗传学探针的设计方法、制作过程及其在课堂教学上的应用。
得出了概念探针有助于厘清学生混淆的概念、检测学生对生物学概念的认识，帮助教师及时调整教学计划的结论。
关键词初中生物学遗传学部分概念探针教学中图分类号G633.91文献标识码B初中生物学“遗传部分”概念探针研究高明英汪旭王重力*（云南师范大学生命科学学院云南昆明650500）1概念探针概念探针又称为形成性评价探针,是一种为了更好的完成教与学，对于学生学习前概念和学习中的概念进行检测的习题。
概念探针侧重于检测学生的认知过程，设计的形成性评价探针是用于解决学生学习研究中鉴定到的困难。
概念探针是一种递进式的多项选择题，包括两个部分：第一部分是在给定的情景下让学生做出自认为正确的选项，这些选项来自于对学生以往的概念进行判定性的结果；第二部分则要求学生对他们自己的选择作一个开放性的解释，为什么作出这样的选择。
第二部分对学生的思考提供了一个根据，学生描述的是来自他们的直觉或直言判断。
这些判断理由有可能来自于他们之前的学习，或者他们在学校里学习到的陈述性知识。
探针的第一部分给教师提供了一个学生是怎样思考的第一印象，第二部分则提供了更多有关学生个人思维过程的详细信息，而且这是在班级里大多数学生一致的看法。
2概念探针的作用2.1检测前概念教师在开始讲授新课之前，可以使用评价探针来发现学生的看法。
教师可以使用这些信息来调整自己的教学策略，并且帮助所有的学生在他们已有的观点和科学概念之间搭建一座“桥梁”。
在开始学习某个单元之际，教师使用一两个探针来确定学生的已有观点，然后针对学生现有的看法设计自己的教学方法，指导、监测学生认知变化和概念转变。
2.2转变前概念教师可以快速地分析来自于评价探针的信息，并且用于设计明确针对学生观点的教学使用策略，指导学生通过一个概念转变。
这个探针可以在开始教学单元之前使用，即在当反馈暗示着有改变课程的需要时，或者在需要使用差异教学或单独教学来满足个别学生的需求时。
定量PCR Taqman探针设计要领-2
定量PCR Taqman探针设计要领-2第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。
其中需要注意的是：* 扩增酶最好选用热启动酶* 引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。
* 同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）* DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲进行2 Ste p RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。
第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。
最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。
所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。
使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。
大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
生物检测技术——核酸探针
3)单链DNA探针和双链DNA探针
➢ 用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与 被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之 间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果 使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一 问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序 列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合 成单链cDNA探针。
核酸探针的前景
➢ 基因芯片在环保方面、食品检测方面的研究报道比较少， 这将成为将来的研究方向。从某种意义上我们可以认为： 基因结构或种类决定物种，基因功能或表达则决定生命即 生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条 认识生命本质的捷径，同时它的发展也带动了蛋白质芯片、 细胞芯片、多肽芯片、组织芯片的发展和应用。
➢ 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱 基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定 基因片段的检测。
核酸探针的标记物
一.放射性标记
➢ 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的 探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中， 以32P应用最普遍。
➢ 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级； 缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、 不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实 现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射 性标记的探针。
➢ 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产 前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的 基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出 其巨大的应用解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
➢ 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合 成法。双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必 须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链 目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温 度以下，可使探针保持单链状态。
近红外荧光BSA-CdSeTe探针的制备及在生物学中的应用
： ； ； ； ； Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ＮＩＲ ＣｄＳｅＴｅ ＱＤｓ ＢＳＡＣｄＳｅＴｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
； 收稿日期：２０１７０６２６ 修回日期：２０１７０９１３ 基金项目：国家重点研发计划重点专项（ ， ， ， ）资助 ２０１６ＹＦＣ１１００９００ ２０１６ＹＦＣ１１００９０１ ２０１６ＹＦＣ１１００９０２ ２０１６ＹＦＣ１１００９０３ 联系人简介：赵强（１９７３），男，副教授，主要从事生物材料的研究。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｑｉａｎｇ＠ ｓｃｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅａｒｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｏｆ ＢＳＡＣｄＳｅＴｅ
， ， ， ， ＨＵＡＮＧ Ｈｕａｙｉｎｇ ＬＩ Ｚｈｅｎｚｈｅｎ ＯＵＹＡＮＧ Ｓｉ ＲＥＮ Ｃｈａｎｇｊｉｎｇ ＺＨＡＯ Ｑｉａｎｇ
Ｔｈｅ ＢＳＡＣｄＳｅＴｅ ｐｒｏｂｅｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ＣｄＳｅＴｅ ＱＤｓ ａｎｄ ＢＳＡ ｗｉｔｈ ＥＤＣ ／ ＮＨＳ． ＣｄＳｅＴｅ ＱＤｓ ａｎｄ ＢＳＡＣｄＳｅＴｅ ｐｒｏｂｅｓ
（ ） ， ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ λｅｘ ＝ ４７０ ｎｍ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＣｄＳｅＴｅ ＱＤｓ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
肽核酸知识介绍
PNA(肽核酸)—新型高效的分子探针和miRNA抑制剂PNA（peptide nucleic acid）中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成DNA类似物，它与DNA分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与DNA一致。
PNA可以通过碱基互补配对原则与其互补的DNA或RNA序列紧密结合，形成稳定的双螺旋结构。
由于PNA没有带电的磷酸基团，不产生静电斥力，使得PNA/ DNA 之间的结合力比DNA/ DNA之间要强得多。
此外，PNA/DNA、PNA/RNA的杂交不同于DNA/DNA、DNA/RNA杂交，基本不受杂交体系盐浓度影响，表现出极高的杂交稳定性、优良的序列识别特异性、较宽的PH范围适应性以及不被核酸酶和蛋白酶水解等优点。
PNA与DNA的比较基于PNA的 Real-Time PCR Clamp技术(PNA Clamp TM Technology)主要依赖PNA探针的两个重要特性：第一，PNA只能与完全配对的互补DNA链杂交。
由于PNA/DNA双链的热力学稳定性要高于相应的DNA/DNA双链，与DNA不同的是，只要有单一碱基发生错配，PNA就不能与互补的DNA链结合；第二，PNA寡聚体不能被DNA聚合酶识别，从而不会成为Real-Time PCR扩增的引物。
相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止相应的PCR扩增。
一旦模板中目的基因发生突变并因此出现错配，DNA/PNA双链结合松动，DNA寡聚体模板链就可以正常延伸，作为PCR引物，使发生突变的样本在Real-Time PCR中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。
选择PANAGENE公司PNA产品的理由2007年6月1日韩国Panagene公司获得了哥本哈根发明家团体（CIG）授予销售PNA Monomers（肽核酸单体）的许可，允许Panagene公司合成、制造并销售PNA供研究人员使用。
Panagene曾获得CIG专利下PNA定制合成的全球独家授权。
可检测肿瘤细胞GSH浓度的光学探针及其设备制作方法和应用与相关技术
一种可检测肿瘤细胞谷胱甘肽GSH浓度的光学探针，为MnO2ICG光学探针，利用MnO2装载吲哚菁绿ICG时猝灭吲哚菁绿ICG在近红外二区的荧光，再利用肿瘤细胞谷胱甘肽GSH和MnO2之间的氧化还原反应，使装载在MnO2的吲哚菁绿ICG的荧光进行恢复。
本技术探针制备简单易操作，且原理基于GSH使纳米探针可以快速且有效的荧光恢复，从而通过近红外荧光成像快速且高效的检测标记肿瘤细胞。
此方法具有独创性且实用性很高。
技术要求1.一种可检测肿瘤细胞谷胱甘肽GSH浓度的光学探针，其特征在于为MnO2-ICG光学探针，利用MnO2装载吲哚菁绿ICG时猝灭吲哚菁绿ICG在近红外二区的荧光，再利用肿瘤细胞谷胱甘肽GSH和MnO2之间的氧化还原反应，使装载在MnO2的吲哚菁绿ICG的荧光进行恢复。
2.根据权利要求1所述的可检测肿瘤细胞谷胱甘肽GSH浓度的光学探针的制备方法，其特征在于由以下工艺得到的：a、采用静置混合KMnO4和聚烯丙胺盐酸盐PAH的方法制备纳米材料MnO2；b、使用EDC/NHS作为偶联剂，将吲哚菁绿ICG溶于水后与MnO2搅拌使吲哚菁绿ICG装载到MnO2得到MnO2-ICG光学探针。
3.根据权利要求2所述的可检测肿瘤细胞谷胱甘肽GSH浓度的光学探针的制备方法，其特征在于：所述步骤a中纳米材料MnO2的制备方法为，直接将KMnO4和还原剂PAH混合静置15-20分钟得到纳米材料MnO2。
4.根据权利要求2或3所述的可检测肿瘤细胞谷胱甘肽GSH浓度的光学探针的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，采用18ml浓度为3.5mg/ml的KMnO4和2ml浓度为37.4mg/ml的聚烯丙胺盐酸盐PAH静置混合15-20min即可得到MnO2，然后使用150000-180000r/min离心机离心5-8min去除大于100nm的颗MnO2颗粒。
5.根据权利要求4所述的可检测肿瘤细胞谷胱甘肽GSH浓度的光学探针的制备方法，其特征在于：所述步骤b中取1ml溶于水的浓度为10mg/ml吲哚菁绿ICG与离心得到的MnO2搅拌3-5小时，搅拌过程中加入EDC/NHS作为偶联剂，其中MnO2与EDC/NHS偶联剂的质量比为1:5-10，最终得到的溶液使用15ml-30KD的超滤管在8000-10000r/min下离心8-10min得到MnO2-ICG光学探针。
纳米离子探针实验室样品制备说明
纳米离子探针实验室样品制备说明：NanoSIMS的样品制备对于获得最佳的实验数据是极其重要的。
样品必须满足以下条件：固态，良好的平整度，符合仪器真空条件，良好的导电性。
仪器分析时，分析腔真空接达到10-10 mbar，远远高于扫描电镜与电子探针。
形状不规则的样品需要注胶入环氧树脂中，然后磨平表面至分析层。
有些样品需要压入在金箔表面上，但是这种情况下很难保证样品的平整度。
为了满足仪器分析的真空，样品需要在真空系统内数日之后再进行分析，尤其对于使用的是树脂注胶处理后的样品。
1.样品尺寸：NanoSIMS样品盘可以放入直径为10mm,13mm(1/2 inch),25mm(1 inch)的样品靶。
每个孔的尺寸范围如下：尺寸最大最小10mm 10.4mm 9.0mm1/2inch 13.1mm 11.7mm1inch 25.7mm 24.4mm✧如上图所示，样品卡在一个圆环边缘处，然后由后面的弹簧片上紧。
所以，样品的尺寸一定要小于圆环外边缘的尺寸。
✧三种样品盘型号如下图所示2.树脂我们实验室树脂采用美国NASA的配方，由3种试剂组成：1，Araldite 506 resin为环氧树脂，2，1.8-Diamino-p-menthane（DAP），3，1-（2-Aminoethyl）piperazine （AEP）（纯度99%）。
2和3分别是固化剂和稀释剂。
配方为1：2：3=7.5：7：1。
固化温度为40-50摄氏度。
3.抛光4.喷金/碳绝缘样品通常需要喷金/碳，厚度约为10nm左右。
我们实验室可以提供喷金/碳服务。
之后样品放入真空干燥箱内保存，以待分析。
5.生物样品的制备针对不同的生物样品的分析要求采用不同的制备流程：✧观察样品的表面结构，非断面或内部结构：样品需要戊二醛固定在高纯硅片、或者铜网上，之后采用乙醇或丙酮进行脱水，干燥之后进行导电镀膜处理。
✧观察样品断面或内部结构：样品按照通常程序进行固定，脱水，然后包埋在树脂中。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
Taqman MGB 探针设计
探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告 基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
05 04 03
Tm值应为65-67℃。 尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于碱基，应避免出现4个或 4个以上的G重复出现。
性； • 探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构； • Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），
以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在 40%－70%； • 探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用， 而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； • 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会 降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； • 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实 一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
实时荧光定量PCR——TaqMan探针法
TaqMan技术引物设计原则
• 序列选取应在基因的保守区段； • 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引
物自身形成环状发卡结构； • 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，
并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 • Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%； • 引物之间的TM相差避免超过2℃； • 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以
上连续相同的碱基； • 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； • Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； • 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。