第七章 原位杂交

第五节 显示 显示又称检测，是指通过一定方 法使杂交反应形成的杂交体（杂交 信号）成为显微镜下肉眼可看见、 识别的产物。对原位杂交反应的信 号进行显示的方法因探针的标记物 不同而已。
一、放射性同位素标记探针的显示
用 32P、 125I、35S等放射性同位素来标记探 针，用放射自显影技术检测杂交信号。 放射自显影是利用感光乳胶记录被研究材 料中放射性物质分布和定位的方法。在原位杂 交中，放射自显影术的基本过程包括：组织切 片中结合在探针上的放射性同位素以某种射线 使感光乳胶曝光后先形成潜影，再经显影、定 影和水洗等程序后获得影像。
第一节 原位杂交组织化学标本的制备
一、取材 用于原位杂交反应的组织应尽可能新鲜， 这就要求取材迅速。由于很多RNA极易降解， 因此取得的组织应尽可能迅速固定或冷冻。 为了避免外援性RNA酶引起靶组织中RNA的 丢失，取材时应戴手套，所用的器械、容器 都要经高压消毒，或清洁后用经焦碳酸二乙 酯（DEPC）处理过的灭菌蒸馏水清洗。此外， 要避免用含RNA酶很丰富的手直接接触组织、 器械、容器和溶液等。
微波炉处理不仅能使双链的探针和 靶核酸有效地变性，而且还能使杂交 信号增加。 二、杂交液 杂交液内除含一定浓度的标记探 针外，还含有较高浓度的盐、甲酰胺 、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体 DNA和RNA等。 Na+ 可使杂交率增加，还可减低探 针与组织标本之间的静电结合。
甲酰胺可使Tm值降低； 硫酸葡聚糖能与水结合，从而减 少杂交液的有效容积，提高探针有 效浓度，以达到提高杂交率的目的 。 牛血清白蛋白及载体DNA或RNA 等，都是为了阻断探针与组织结构 成分之间的非特异性结合，以减低 背景。
三、 切片 在原位杂交中，以冰冻切片最常用。 在切片时，要尽量避免RNA酶污染，操作 时要戴手套，用70％酒精或10％SDS擦洗 工作台、切片机刀架、摇柄和载物台等手 常接触的部位以及其它器械。切片厚度可 根据具体情况而定。如靶组织中待测 mRNA的量较少，所采用的原位杂交技术 敏感性较低，为了能得到较多的信号，切 片可厚些（约15～20µ m），反之，则可薄 一些（约5～10µ m）。
四、显示系统对照 （一）放射自显影显示系统对照 阳性对照是将浸渍乳胶的空白片在光线下曝 光后显影，阳性结果证明乳胶及显影过程工作 正常。 阴性对照是将空白片浸乳胶后不经曝光便与 原位杂交标本一起进行显影，结果应为阴性。 如果阴性对照照片上有较多的银粒，则说明 乳胶有放射性污第三节 杂交反应 杂交液的成分与预杂交液基 本相同，所不同的是加入了标记的 核酸探针。杂交前的准备只是为杂 交的成功奠定基础。
一、 双链DNA探针和靶DNA变性 进行杂交反应时，探针与靶核酸都 必须是单链。 探针和靶核酸一旦变性，要马上进 行杂交反应，否则，解链的核酸又会重 新复性。 如果用单链探针检测靶RNA，一般 不需变性。
二、探针对照
（一）已知阳性组织和已知阴性组织对照 阳性组织和已知不含靶核酸的阴性组织 标本上进行原位杂交，应分别得到阳性结果 和阴性结果。如果已知阳性组织出现阴性结 果，则应对探针的制备及原位杂交的各个步 骤进行检查。相反，如已知阴性组织出现阳 性结果，则提示存在非特异性的杂交信号。
（二）用有意义链RNA探针做原位杂交 因 为 无 意 义 链 RNA 的 碱 基 序 列 与 靶 mRNA的碱基序列互补；用有意义链RNA探 针进行原位杂交应得到阴性结果，这是证明 探针特异性较好的阴性对照。
应用：
研究单一细胞中编码各种蛋白质， 多肽的相应mRNA 的定位，从分子 水平研究细胞内基因的表达及有关 因素的调控。主要用在细胞或组织 的基因表达，染色体分析，病毒诊 断和发育生物学。
二、原位杂交组织化学基本技术

由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体 应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法 和应用原则大致相同。大致可分为： ① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织 的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背 景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示（visualization）：包括放射性自显影 和非放射性标记的显色。
（二）预杂交
以阻断标本中可能与探针产生非特 异性结合的位点，达到减低背景染色的 目的。
（三）内源性生物素和酶的抑制 组织中内源性生物素、过氧化 物酶或AKP则应事先阻断。 标本可用不标记的卵白素－生 物素孵育，以阻断内源性生物素。
杂交前蛋白酶消化有利于消除内 源性生物素的干扰。 用5％脱脂奶粉缓冲适宜的盐液 来稀释标记的卵白素以及将标记标 本浸于含2％牛血清白蛋白的缓冲液 ，均可防止或抑制标记的卵白素与 组织标本之间的非特异性结合。
杂交反应的时间可能随探针浓度的 增加而缩短,但在一个相当大的浓度范围 内,杂交反应 6h内完成。在实际操作中,
一般把杂交时间定为16～20h,或为了 工作方便,将杂交液和标本孵育过夜。 然而,杂交时间不要超过24 h,反应时 间过长,形成的杂交体会解链,杂交信 号会减弱。
六、杂交严格度(hybridization stringercy)
绝大部分的非放射性原位杂交是以 免疫组织化学方法进行显示的，在对照 试验中应包括免疫组织化学的一系列阳 性对照和阴性对照。具体对照试验的种 类、操作方法与结果分析请参阅有关篇 章或免疫组织化学专著。
第七节 原位杂交组织化学常用操作程序 一、应用放射性同位素标记的寡核苷酸探针 （一） 取材和切片 1、 取材 （1）新鲜组织速冻法：将动物麻醉后断头， 迅 速 取 材 ， 并 立 即 以 干 冰 或 液 氮 速 冻 10 ～ 20min。 （2）灌注固定法：将动物麻醉后，经心脏先 灌注温生理盐水，再以4％甲醛－0.1mol/L磷 酸缓冲液（PB，pH 7.2）灌注固定，取材并浸 于同样固定液中再固定2～4h，然后将取材浸 入20％蔗糖－PB于40C冰箱过夜。
第八章

原位杂交组织化学
原位杂交组织化学（In situ hybridization histochemistry，ISHH）是应用已知碱基 顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原 则进行特异性结合，形成杂交体，然后再 应用与标记物相应的检测系统通过组织化 学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行 细胞内定位。
三、探针的长度 探针的最佳长度应在30～100碱基之 间。探针短，易于进入细胞，杂交率高 ，杂交时间短。 四、探针的浓度 探针的浓度远比组织中靶核酸的浓 度要高。一般为0.5～5.0µ g/ml，通常建议 放射性同位素探针浓度为0.5µ g/ml，非放 射性探针为2µ g/ml。
过量的杂交液含核酸探针浓度过 高，反而导致高背景染色等不良反应。 五、杂交温度和时间 杂交温度应低于杂交体的融解或 解链温度（Tm）20～30℃,大约在30 ～60℃之间,因为在这一温度条件下 进行杂交反应,杂交率最高。一般常 用的杂交温度为42℃左右。
二、 固定 在固定剂的应用和选择上应 兼顾到三个方面，即保持良好的 细胞结构，最大限度地保持细胞 内DNA或RNA的水平及使探针易 于进入细胞。
（一）固定剂 化学固定剂有沉淀固定剂和交联固 定剂两类。常用的沉淀固定剂有乙醇和 丙酮等，经用沉淀固定剂固定的组织通 透性较好，利于探针穿入组织。但沉淀 固定剂可能引起RNA的丢失，而且组 织的形态结构保存也不十分理想。
（二）固定方法
先行灌注固定，然后取材并将取下 的组织浸入固定液中再行浸渍固定。经 固定和漂洗后的组织也可在15％蔗糖磷 酸缓冲液中于40C下保存1～2个月。新鲜 组织也可以在取材后直接以液氮或干冰 速冻，冰冻切片后再浸入4％多聚甲醛固 定10～30分钟，干燥后立即进行杂交或 保存在-700C冰箱内。如果冰箱温度恒定 ，可保存数月之久。
第六节 对照试验 一般应在下述几种对照试验中 选择3～4种以证实杂交结果的可靠 性。 一、 组织对照
（一）Southern或Northern印迹反应
（二）免疫组织化学 如果能获得靶基因产物的抗体 ，可结合免疫组织化学和原位杂交 ，从蛋白质（或多肽）水平和转录 水平在相邻切片或同一切片中证明 蛋白质（或多肽）和相应的mRNA 共存于同一细胞中。
2、 切片 将速冻的组织或灌注固定的组织 在 恒 冷 箱 切 片 机 中 切 片 （ 厚 15 ～ 20µ m）。将切片贴于有粘胶剂的载 玻片上，37℃或室温干燥以增加切 片的粘附性。如不立即进行杂交处 理 ， 可 将 切 片 储 藏 于 － 20℃ ～ － 80℃的环境中（可保存数月）。
交联固定剂有多聚甲醛、戊二醛等。 醛类交联固定剂可较好地保存组织中的 RNA，对组织形态结构的保存也优于沉 淀固定剂。但由于戊二醛这样的强交联 固定剂固定后的组织通透性很低，探针 较难进入其中。一般认为，4％多聚甲醛 对检测mRNA的组织固定较为理想，它 既能有效地保存靶组织的形态结构，又 可使组织具有一定的通透性。
常用的去污剂是Triton-X100，一般 都将切片浸入含0.2～0.5% Triton X-100 的PBS内15min 。 蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十 分重要。 蛋白酶K还具有消化包围靶DNA的 蛋白质的作用，从而提高杂交信号。
二、 减低背景染色 （一） 酸酐和稀酸处理 稀酸处理能使碱性蛋白变性 ，如再结合蛋白酶消化，即可将碱 性蛋白移除，这样不仅能增强靶核 酸探针的可及性，也可避免碱性蛋 白与核酸之间的非特异性结合，达 到解降低背景的目的。
错配对杂交体的稳定性较完全配对的 杂交体的稳定性差。 影响严格度的因素有甲酰胺的浓度、 杂交温度和高离子强度，因此可通过控制 这些因素来减少非特异性杂交体的形成， 提高杂交的特异性。在低甲酰胺浓度、高 离子强度和低杂交温度条件下，严格度低 ，反之严格度就高。
严格度越高，杂交反应的特异性 越强，但敏感性越低；反之，特异性 越差，而敏感性越高。 在杂交时，将杂交液滴于组织切 片上后，应加盖硅化的盖玻片，防止 孵育过程的高温导致杂交液的蒸发， 必要时可在盖玻片四周加橡皮泥封固 盖玻片。
第四节 杂交后处理 杂交后处理的目的是除去未参 与杂交体形成的过剩探针，除去探 针与组织标本之间的非特异性结合， 包括与那些与靶核酸相似的序列与 探针之间形成的含非互补碱基对的 杂交体，从而减低背景。