荧光原位杂交的认识

对荧光原位杂交技术的认识 摘要:荧光原位杂交技术（FISH）作为分子水平的微生物检测技术，已成为目前首要生物学核酸检测技术，本文主要介绍了FISH的发展及在污水处理中的应用，重点介绍了在硝化细菌方面的应用，并给出了FISH技术存在的缺陷及改进的方法。 Abstract: Fluorescence in situ hybridization (FISH) , as a microbial molecular detection technology, has become the first biology nucleic acid detection technology. This paper introduces the development of FISH and the application in wastewater treatment, and mainly introduces the application in nitrifying bacteria.Further more,it also describes the disvantages in FISH and the improved methods. 关键词：荧光原位杂交技术（FISH），16S rDNA(16S rRNA),污水生物处理 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization）是在同位素原位杂交技术基础上发展起来的非放射性原位杂交方法，起始于20世纪70年代后期。它以16S rDNA(16S rRNA)探针用特殊的核苷酸分子标记然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维素切片上的定性，相对定量分析。有不同细菌的16S rDNA都有其独特序列，利用这些独特的序列制成的探针可以鉴别和跟踪自然样品中的目标细菌。最初FISH技术应用于医疗事业，目前FISH技术的应用范围也来越广，特别是FISH流程的简化完善和检测灵敏度的提高，使FISH成为一种首要的生物学核酸检测技术。 1. FISH的发展历史 1969 年, Pardue【1】 等和John【2】两个研究小组开发了原位杂交技术, 用放射性同位素标记的DNA 或28S rRNA 和爪蟾卵细胞制备物进行杂交, 然后进行显微放射自显影检测。这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下, 检测出细胞核酸序列, 自此, 原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。 早期的同位素标记没有专门的标记方法，将随机同位素标记的碱基添加到 生长的细胞中再进行放射自显影。虽然灵敏度高，但是放射性材料因半衰期较短引起探针不稳定，且分辨率有限，检测周期长，价格相对较昂贵，必须按照严格的程序转运、贮存和处理有放射性的材料。【3】 1980年，Bauman【4】首次将荧光原位杂交用于核酸检测，直接接将RNA-3’端用荧光素标记作为特异DNA 序列的探针。氨基-烯丙基标记碱基技术可以与任何半抗原或者荧光素结合，这对于原位杂交是至关重要的，因为氨基-烯丙基标记的碱基技术可以仅通过简单的化学反应就可以获得一系列的低背景信号探针，通过杂交探针的二级检测系统使得杂交信号被放大。早在19 世纪80 年代，缺口平移法检测、生物素标记探针，二级荧光标记抗体检测等方法已经用于DNA【6】 和mRNA 【7】检测。 FISH 不仅用于单基因或核酸检测，FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。【3】

Pinkel【8】等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测，采用双色激发块装置照相机检测荧光信号，而且定量分析技术很快用于了mRNA 检测。

1988年, Giovannoni【9】 等首次将FISH 技术引入细菌学研究中, 使用放射性标记rRNA 寡核苷酸探针检测微生物。随着荧光标记的发展, 非同位素染料逐渐代替。1989 年, Delong【10】首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。 2. FISH的应用 在废水处理工艺中，对微生物鉴定的方法很多，传统的微生物的检测方法基本上有菌种分离培养法，镜检计数法。菌种分离培养法对一些培养条件苛刻或没被培养过的细菌用途不大，重要的是它不能精确的反应菌群的组成及多样性。镜检计数法，不但费时费力，还可能因为微生物形态、特性类似把它们当作同种微生物记错数，同时，没有活性的微生物有可能也会被计入总数。随着分子生物学技术的发展,分子生物学方法已经成为现代环境微生物学的重要手段。 与放射性探针相比, 荧光探针更安全, 具有较好的分辨力, 不需要额外的检测步骤。此外, 可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针, 在一步反应中同时检测几个靶序列。该技术特异性和敏感度都很高，使得那些环境中数量少，培养难度高的微生物的研究方便快捷了很多。 不仅可以应用到环境样品微生物多样性和污水处理中生物多样性的研究还可以应用到微生物群落组成及空间分布，原位生理学和功能性研究和特殊菌种的研究。 在聚磷菌方面的应用 荧光原位杂交(FISH)技术在聚磷菌的研究中可以在一定程度上反映污泥中聚磷菌的组成和空间结构。2008年，张勇【11】等通过正交试验筛检可以确定FISH技术在检测反应器中聚磷菌最佳的优化条件。在固定前应先经过1 ×PBS清洗两次, 37℃热固定3 h,乙醇脱水3 min; FISH技术检测反应器中聚磷菌的最佳实验条件为:杂交温度46℃,杂交时间2 h,清洗缓冲液中NaCl浓度70 mmol/L。使聚磷

菌的定量检测更加快、简便、准确。亢涵,王秀蘅【12】等应用FISH 对以乙酸钠为碳源的强化生物除磷(EBPR) SBR 反应器启动期的微生物进行原位分析,考察了除磷生态系统形成过程中聚磷菌种群结构、空间分布关系动态变化及其聚磷特性。 在厌氧反应细菌的应用

Santegoeds 【13】等人利用ARC915 ,SRB385 ,DSV698 和DSS658 等探针发现,产甲烷菌主要分布在颗粒污泥的内部,而硫酸盐还原菌则分布在外层;Sekiguchi【14】 等人也得到类似结论。2006年，许鑫【15】等应用FISH检测厌氧反应器里

的硫酸盐还原细菌，并对其试验条件进行优化。硫酸盐还原菌的较好的杂交条件是杂交温度46℃，杂交时间3h, NaCl浓度为90mmol/L。杂交时间和温度均影响探针的特异性，在一定温度范围内提高杂交温度会提高探针的特异性；杂交时间过短会造成探针结合不完全，过长会增加非特异性着色；杂交洗脱液NaCl浓度过高会降低探针特异性。同年，陈瑛，任南琪【16】等应用FISH技术研究了连续流搅拌槽(CSTR)解析发酵产氢细菌中的2 种产氢发酵类型的菌群组成和发酵类型转化过程中的菌群种类和数量变化及其对产氢速率、生物量和发酵产物的影响. 结果表明,梭菌属和肠杆菌科在决定产氢发酵类型方面有重要作用. 以梭菌为优势种群的乙醇型发酵比以肠杆菌为优势种群的丁酸型发酵具有更佳的产氢能力。

Harmsen【17】等人利用EUB338 ,ARC915 ,MX825 和MG1200 等探针的不同组合以蔗糖为基质和以混合酸为基质的颗粒污泥分层不同。其前者为：三层，由外到内，真细菌，产氢产乙酸细菌和产甲烷丝菌的共生体，较大空洞有少量产甲烷细菌和无机物。后者为两层，外层真细菌，内层产甲烷丝菌为主。 对肠道细菌的应用

1995年，Langendijk等【18】首次采用探针Bif164用FISH对人肠道双歧杆菌进行定量分析。2004年，Takada等【19】用3种不同荧光集团组合，并用7种针对双歧杆菌的探针染上不同的探针，成功的运用了多色荧光原位杂交技术。2004年，王建龙【20】利用FISH检测水体中大肠杆菌，可以在一天内给出定量检测结果。但还没有广泛用于饮用水中的大肠菌群计数，原因是饮用水中的细菌因缺乏营养物处于饥饿状态且受消毒剂的影响。其细胞内的染色体含量较低，是杂交产物的荧光信号很弱。利用PAN（是一种合成的核酸,用肽骨架取代了核酸中的戊糖- 磷酸骨架,是一种新型的DNA 模拟物,具有与DNA 和RNA 结合的高度亲合性和良好的稳定性)代替DNA或利用荧光扩增系统可以提高检测的灵敏度和杂交信号的荧光强度。 在生物脱氮方面的应用

Helmer【21】等以NSO1225探针和Amx208202a2A222探针分别对生物膜内细菌进行了FISH检测, 发现亚硝酸细菌主要分布于生物膜的好氧表层, 而厌氧氨氧化菌( Kuene2nia stuttga rtiensis) 则主要分布于生物膜的缺氧内层。Michael【22】等用同样探针对CANON(Completely Autotrophic Nitrogen OverNitrite) 反

应器中的颗粒污泥进行研究时也发现了类似的结果。Schramm【23】等应用FISH技术并将聚焦显微镜和相差显微镜图像叠加，对硝化流化床反应器中活性污泥内硝化细菌的空间分布进行原位分析，发现氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌紧密结合

在一起的形态特征。IngoSchmidt【24】等在研究好氧与厌氧氨氧化菌的生存关系时发现Kuenenia stuttga rtiensis和Brocadia anammoxidans Dokhaven紧密