荧光原位杂交(FISH)实验步骤
仪器设备
1、 医用微波炉；
2、 水浴锅；
3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；
4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂
（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
（2）20×SSC（pH7.0）；
（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
实验步骤
1、脱蜡：
1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2）100％酒精两次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：
1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5）空气干燥。
4、杂交：
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。 10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：
12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
PRINS步骤
1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；
5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；
6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；
9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；
13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。
荧光原位杂交实验步骤
荧光原位杂交实验步骤
嘿，咱今儿个就来讲讲这荧光原位杂交实验步骤哈！这实验呢，就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得踩准点儿。
先说说样本准备吧，这就好比是给舞蹈演员选好合适的服装和道具。得把样本处理得妥妥当当的，不能有一点儿马虎。要是样本没弄好，那后面的步骤可就都白搭啦！你说这重要不？
接下来是探针标记，这就像是给舞蹈演员化上独特的妆容，让他们在舞台上更加耀眼。得把探针标记得精准无误，这样才能在后续的过程中准确找到目标呀。
然后就是杂交啦！这就好像是舞蹈演员们在舞台上开始尽情舞动。要让探针和样本完美结合，就像舞者之间的默契配合一样。这可不是随随便便就能做到的哟！
杂交之后还得进行洗涤，这就好比是舞蹈结束后给演员们清理一下身上的汗水和灰尘。把那些多余的、不需要的东西都洗掉，只留下最精华的部分。
再之后就是检测啦！这就像是观众们在欣赏舞蹈表演，要能清楚地看到演员们的精彩表现。通过检测，我们才能知道实验的结果到底怎么样。 最后是分析数据，这就像是对舞蹈表演进行评价和总结。看看哪些地方做得好，哪些地方还需要改进。这一步可不能小瞧，它能让我们不断进步呢！
你想想看，要是在实验过程中有一步没做好，那不就跟舞蹈中有人跳错了步子一样明显吗？所以啊，每一个步骤都得仔仔细细、认认真真地去做。
做这个实验就跟盖房子似的，每一块砖都得放稳了，房子才能坚固。咱可不能图快就马马虎虎地做，那最后肯定得出问题呀！这荧光原位杂交实验可是个精细活儿，得有耐心、有细心，还得有那么点儿小技巧。
咱可不能小看了这些步骤，它们就像是一个个小环节，串起来才能完成这个大实验。就像那句话说的，“千里之行，始于足下”，咱得一步一个脚印地把这实验做好。
总之呢，这荧光原位杂交实验步骤可都不简单，每一步都得用心去对待。只有这样，咱才能在实验中取得好的结果，才能真正领略到科学的魅力呀！你说是不是这个理儿？
荧光原位杂交 操作
荧光原位杂交 操作
荧光原位杂交（FISH）是一种基因组学的技术，它使用荧光探针将特定的DNA序列定位在染色体上。这种技术被广泛用于分析染色体的结构和功能，以及人类基因组变异和疾病的研究。本文将介绍荧光原位杂交操作的步骤。
步骤1：样品制备
FISH技术可以应用于不同种类的样本，如人类细胞、动植物组织等。对于人类细胞的样本，常用的方法是将细胞分离，制作成染色体悬液。
首先要通过荧光染色法把两种不同的染色体和特定的基因序列染成不同的颜色。这需要用到已知基因序列的探针，可以从已有的文献中获取。如果没有，可以通过设计和合成新的探针。
步骤2：制作探针
FISH探针是由一段DNA片段制成的。这个片段可用PCR方法从DNA中扩增出来，或者可以通过化学合成的方法制造。制造探针时需要注意，探针的长度和序列应该与目标序列相匹配，可以通过BLAST或其他基因数据库检索确认。
通常使用荧光染料标记探针，以便在镜头下观察到探针的定位。常用的标记分子有荧光素（FITC），荧光素同路胺（rhodamine）和锔（Cy3和Cy5）。这些分子的选择取决于探针和荧光显微镜系统的兼容性。
在制作FISH探针时，需要注意探针的特异性和灵敏度。为了达到这一目的，需要经过一系列的标记、纯化和探针肢解操作。
探针一般都是双链DNA，通过加入单链转化酶（S1）或DNA酶I，使双链DNA变成单链DNA，并标记在其5'-末端上。标记完成后，进行染色体裂解、脱氧核糖核苷酸（dNTP）和DNA聚合酶的反应来进行回收和标记探针，以免对染色体质量产生影响。对于高复杂度的基因组，可以使用克隆探针阵列，在单个染色体上定位多个序列。
步骤4：染色体固定和前处理
将样本固定在载玻片上，这可以是用乙醛和甲醛等固定剂进行固定。将载玻片上的样本通过逐步浸入水，逐步替换固定样本中的有机溶剂来除去样本中的RNA，然后用类碱/类酸（如乙酸/氯化锂，0.1M Na丙二酸缓冲pH 9.0）进行前处理，以增加荧光探针的穿透率，使其更好地结合DNA的目标序列。
FISH荧光原位杂交
(1) 玻片预处理
玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，清水浸泡过夜；1%的盐酸浸泡24小时，蒸馏水清洗干净后置0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）中浸泡过夜。
硅化处理：将载玻片和盖玻片用1%的盐酸煮沸10min后，用0.1%DEPC处理的蒸馏水冲洗，60℃烘干。盖玻片用锡纸包好4℃保存备用。
黏附剂涂片制备：载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液中约1min，取出用灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥，然后置4℃保存备用。
(2) 样品采集和预处理
取样：用经高压灭菌的聚乙烯管子取湿地基质并称量，加灭菌蒸馏水适量振荡混匀，超声波处理使细菌分散。取清洗下来的悬浊液约1ml进行后续处理。
样品固定与清洗：悬浊液中按1:1加入4%多聚甲醛于4℃固定24小时；将固定样本用磷酸缓冲液(PBS)10000r/min离心漂洗二次，弃去上清液。用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于-20℃保存备用。
热固定与脱水：取10μl样品在载玻片上涂抹24mm×24mm大小，37℃的烘箱热固定2h后依次用50%，80%，96%乙醇室温下脱水3min，室温干燥。
(3) 杂交反应
硝酸菌的探针见表4.2：
杂交液配置：总细菌、硝酸细菌、亚硝酸细菌杂交液中去离子甲酰胺（DAF）浓度分别为20%、40%或55%去离子甲酰胺（DAF），其余的相同，SDS 0.1%，Tris-HCl（pH8.0）
20mmol/L，NaCl 900mmol/L。
表5-1硝酸菌与亚硝化细菌探针序列
Tab. 5-1 Probe and sequences of nitrifying bacteria, denitrifying bacteria and total bacteria
细菌 探针名称 探针序列（5’—3’） 5’—标记
总细菌 EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT HEM
硝酸细菌
NIT3 CCT GTG CTC CAT GCT CCG FITC
荧光原位杂交
荧光原位杂交
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列的存在、位置和数量。该技术通常使用荧光染料标记DNA或RNA的探针来识别特定的序列。
在荧光原位杂交中，常常使用单链DNA或RNA的Oligonucleotide探针。探针的序列与待检测样品中的特定DNA或RNA序列互相互补，使得探针和样品DNA或RNA序列可以杂交在一起。探针可以被标记成许多不同的荧光染料，如荧光素、罗丹明等，以使得检测到的探针可根据颜色进行区分。
荧光原位杂交过程包括以下步骤：
1. 选择合适的探针。选择的探针实际上就是一个人工合成的核酸分子，其长度在20-200bp不等，可以与靶序列DNA或RNA中的任意位置相互匹配，检测的种类也包括基因、病毒、染色体等。
2. 标记探针。 标记探针是指把荧光染料等标记物与探针进行化学共价修饰，使之形成标记的探针，标记的探针使用单染色荧光或双染色荧光。
3. 处理样品。 把检测样品进行前处理、处理固定等。
4. 杂交。 把标记的探针打入处理好的样品中，如细胞、组织、染色体等，探针就会与相应的靶分子发生杂交，然后把样品用适当的盐洗。
5. 检测结果。 通过荧光显微镜进行探针的显示，可以看到细胞核内亮相区域，确定靶序列的定位和相应的染色体编号，并可以通过比较实验组和对照组的信号强度，得到目标序列的数量和比例。
荧光原位杂交在基因检测、疾病诊断、癌症诊断和治疗中都有广泛应用。在基因诊断中，荧光原位杂交可以检测微观缺失、染色体重排列和染色体数目异常等，具有高准确度、高敏感度、高特异性和可显性等特点。在肿瘤诊断和治疗中，荧光原位杂交是一种高效而准确的技术，可以评估患者的病情、选择合适的治疗方案，预测预后。因此，荧光原位杂交在生命科学研究和医学诊断中的应用前景非常广阔。
荧光原位杂交(FISH)
荧光原位杂交（FISH）
实验原理
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
实验用具及材料
相关溶液的配制
1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH 至7.0）。
荧光原位杂交技术流程
荧光原位杂交技术流程
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荧光原位杂交（FISH）技术流程。
1. 细胞制备。 收取培养细胞或组织切片。
原位杂交 fish
原位杂交 fish
荧光原位杂交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一门分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
实验方法原理：
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
荧光原位杂交报告单
荧光原位杂交报告单
一、什么是荧光原位杂交？
1.荧光原位杂交（FISH）听起来是不是很高大上？别担心，咱们慢慢捋。荧光原位杂交其实是一种非常酷的生物技术，它通过使用荧光探针来“标记”特定的DNA或RNA片段，让我们能够在显微镜下看到它们的位置。简单说，就是给基因穿上一件亮闪闪的“衣服”，然后我们通过荧光显微镜来观察它们的“身影”。这一过程就像是科学家在做一场基因的大型寻宝游戏，只不过宝藏就是我们想要找到的特定基因。
2.为什么要做这个呢？FISH技术主要应用于基因的定位、染色体的分析和一些病理研究。例如，我们可以用它来判断某些基因是否发生了扩增或缺失，甚至用来发现某些特定染色体上的遗传问题。说白了，这项技术帮助我们“看到”基因，不仅能研究基因的结构，还能追踪它们在细胞里的位置，甚至搞清楚它们是否发生了某些异常。
3.荧光原位杂交报告单到底是怎么一回事呢？如果你正在拿到一份报告单，恭喜你，这说明你正在进入一个充满光芒的基因世界！这份报告单其实记录了所有与FISH实验相关的重要信息，包括实验的结果、使用的探针类型、染色体或样本的编号，甚至包括一些数据分析和图像的处理。可以说，报告单就是FISH实验的“成绩单”，帮你把实验的结果清晰地呈现出来。
二、荧光原位杂交的操作步骤
1.我们接下来就要走进实验的“幕后”了。说到FISH实验的操作，其实并不复杂，但是却需要高度的细致和精准。我们需要从样本中提取出细胞，然后通过一些化学处理，使这些细胞变得适合与荧光探针结合。这个过程有点像在准备食材，咱们需要让细胞“放松”，好让探针能够顺利进入。
2.处理好细胞之后，接下来就到了最有趣的部分：加入荧光探针。这些探针其实是一些特定的DNA或RNA片段，它们能够与目标基因互相结合，就像是钥匙和锁的关系。探针的设计必须非常精准，否则就像拿错了钥匙，根本开不了锁。而一旦探针与目标基因结合，它们就会释放出荧光信号，这样我们就能在显微镜下看到基因的“踪迹”了。
关于细菌的一些荧光原位杂交(FISH)的资料
阿哈湖深层水中微生物和硫酸还原菌数量及群落结构空间变化
本文章中细菌FISH操作流程：
材料方法：
1.样品采集
于2006年6月使用Niskin采样器，从18m深度开始按1m间距采集贵州阿哈湖水深22m处的深层湖水，共采集5个样品（编号为Aha06101-Aha06105），样品立即用45多聚甲醛进行固定。
2.主要试剂和仪器：
多聚甲醛（Sigma，美国）；明胶（Oxiod，美国）；丫啶橙（Sigma，美国）；DAPI（Sigma，美国）；荧光显微镜（Olympus，日本）。
3.荧光探针
采用EUB338和SRB385寡核苷酸探针，5’端Cy3标记（表1），由上海生物工程技术服务有限公司合成。
表1 16S rRNA 探针的靶细菌种属和探针序列
探针名称 序列（5’-3’） 检测的微生物
EUB338 GCT GCC TCC CGT AGG AGT 真细菌
SRB385 CGG CGT CGC TGC GTC AGG 硫酸盐还原菌
4.荧光原位杂交法对阿哈湖深层水环境总微生物、真细菌和硫酸盐还原菌数量的分析
4.1 样品预处理 取1ml样品用直径25mm GTTP滤膜过滤后，1 ml PBS 洗涤3 次后，0.5ml
50%、80%和99.5%乙醇分别洗涤，每次3min，风干。
4.2 原位杂交 湿盒中适量加入杂交缓冲液（EUB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1Tris-Hcl，0.01% SDS，20% formamide；SRB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，35%甲酰胺），将包被有明胶的玻片放于湿盒中，膜放于玻片上。25ng·μl-1探针4μl和杂交缓冲液20μl混匀后，滴加于膜上，38℃ 90min；取出膜放入洗涤液中50℃ 20min （EUB探针洗涤液0.18mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，5mmol·L-1 EDTA；SRB探针洗涤液0.40mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，5mmol·L-1 EDTA）水洗膜，风干；&O &- /7·/? K -的<1=> 4& "? 复染，避光-0 /*$，水洗，风干。
双向荧光原位杂交手册(2_dimension-FISH_protocol)
组织（细胞）间期核2-dimension DNA FISH实验步骤
Note：依照本protocol 进行该实验两大关键因素：
一是样品玻片的制备，包括细胞核释放的多少，点片的细胞密度，玻片背景的干净与否，溶液的新鲜程度，蛋白酶消化的时间等；
二是BAC探针的制备纯化，包括BAC的纯度，探针的质量，不同探针的比例，与样品孵育的时间等；另外，温度，湿度，光照也要严格按要求进行。
一、组织间期核制备过程
1．组织放入平皿中，加含50ul双抗的PBS 5ml泡10min。
2．用PBS洗一下，剪碎。
3．加胶原酶5ul和培养液5ml放入37度过夜。（该步骤只针对不易释放游离细胞的组织）
——过夜消化则以上操作均需在超净台进行，以防污染
（细胞：PBS洗两遍，消化细胞，收集，PBS洗一遍，细胞数太少则不洗）。
4. 将组织碎块（细胞）在15ml离心管中加0.075M KCL 10ml，37 ℃ 水浴锅内低渗30min。
5. 取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3滴混匀，室温1000rpm离心10min弃上清。
6. 加固定液10ml混匀后，室温静置30min，离心弃上清。
7. 步骤6重复三次后加入固定液1.5ml，混匀后静置1~2min，将上层较为清亮的细胞悬液约1ml转于1.5 ml EP管内4℃存放。（长期可置-20℃冻存）
8. 点片：将适当细胞密度的悬液0.2-1µl点于玻片上，用钻石笔在玻片背面划出范围，室温过夜。
二、荧光探针的标记（随机引物）
1. 预变性( PCR仪)
template DNA (ds DNA) 200ng
2.5 x Kenelow buffer (invitrogen) 10µl
ddH2O
---------------------------------------------------
Σ 12.5µl