质粒提取方法详解
提取质粒的主要步骤原理
提取质粒的主要步骤原理提取质粒是一种分离和纯化质粒DNA的常见实验技术。
质粒是细菌细胞内环状的DNA分子，通常用于基因克隆、转化、表达和基因组编辑等研究。
下面将详细介绍质粒提取的主要步骤原理。
1. 细菌培养：首先，选择含有目标质粒的细菌菌株进行培养。
通常使用大肠杆菌等常用实验菌株。
将细菌接种到含有适当营养物质（如LB培养基）的培养物中，并在适当条件下培养，如37摄氏度、220 rpm振荡培养。
2. 收获细菌：将培养至适当生长期的细菌用离心机离心，收集菌体沉淀。
通常使用1500×g离心10分钟，得到一个细菌菌体的沉淀。
3. 质粒裂解：利用物理或化学方法将细菌菌体裂解，释放内部的质粒DNA。
物理方法包括超声波处理和冻融法，而化学方法则涉及使用碱性裂解液（如SDS 和NaOH）。
该步骤破坏了细胞壁和细胞膜，以及核酸酶等酶的活性。
4. 蛋白质沉淀：为了去除细菌染色体DNA和蛋白质，可通过蛋白质沉淀步骤使质粒DNA纯化。
一种常用的方法是加入混合溶液，其中包含非离子性洗涤剂（如SDS）和蛋白酶K。
SDS具有溶解细菌膜和蛋白质的作用，而蛋白酶K能够降解杂质蛋白质。
该反应可以在高温条件下进行，如50-60摄氏度，以增加SDS和蛋白酶K的活性。
5. DNA沉淀：通过加入盐和酒精，可以使DNA溶液中的质粒DNA沉淀。
正常情况下，添加等体积的冷异丙醇，再加入适量的盐溶液。
因为质粒DNA在冷异丙醇和高盐浓度下更容易沉淀。
经过离心，沉淀的DNA可被分离出来。
6. 洗涤和溶解：将DNA沉淀洗涤一两次，以去除盐和其他杂质。
通常使用70%乙醇洗涤，再次离心以分离DNA沉淀，然后去除液体，使其干燥。
最后，用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解质粒DNA，以得到高纯度的DNA溶液。
以上步骤提取质粒的主要原理如下：在收获细菌步骤中，细菌通过离心过程被分离出来，得到菌体沉淀。
在质粒裂解步骤中，通过物理或化学方法破坏细胞结构，释放质粒DNA。
质粒提取方法详解
第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,缍钥股氐目剐缘取质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed cont rol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%.第二节利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
质粒提取方法
质粒提取：质粒是细胞染色体外弄够自主复制的很小的环状DNA分子。
1、将新鲜单菌落或液体培养物接种到5mL液体培养基中，32℃振荡培养至对数生长后期；（振荡速度250-300rpm）2.将菌液倒入1.5mL离心管中，4℃，10000rpm离心20秒，弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液尽可能去尽。
为增加菌体的量，可重复操作2-3次；3.将收集的沉淀重悬于预冷的100μL溶液Ⅰ中，涡旋混匀，使充分悬浮，温室放置5分钟。
4.加入200μL溶液Ⅱ，颠倒混匀，冰浴5分钟。
（1、溶液变成半透明粘液；2、冰浴使染色体DNA片段不至于太小，质粒不容易开环；3、若SDS因温度太低析出，需微热使融）5.加入150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5分钟，（DNA复性）6.12000rpm离心5分钟，将上清液移至1个新的1.5mL的离心管中，（上清液为复性的质粒，沉淀为缠绕的染色体及少量蛋白质）7.加入2倍体积无水乙醇颠倒混匀，室温放置10分钟，（无需-20℃）8.12000rpm离心10分钟，弃去上清液，将管口打开，倒置于吸水纸上，使所有液体尽可能流出。
9.加入1mL75%乙醇（洗去DNA表面的盐类），12000rpm离心5分钟。
10.弃去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使液体流尽，置通风厨中至液体挥干（乙醇需完全挥发）11.将沉淀溶于40μL含20μg/L（2%的浓度）的RNA酶的TE溶液中，38℃放置于10分钟，-20℃保存。
12.检验（DNA溶于水，不溶于酒精）质粒提取中溶液的配制(准备工作)1. 0.5M EDTA（pH=8.0）(10mL)称取1.8g Na2EDTA•2H2O加入约8mL的去离子水，充分搅拌均匀，用NaOH调节pH至8.0（约0.2gNaOH）pH值为8.0时，EDTA才能完全溶解，加入去离子水将溶液定溶至10mL，高温高压灭菌后室温保存。
2. 1M Tris-HCL(pH=8.0)10mL称量1.211g Tris,加入约8mL去离子水，充分搅拌溶解，加入0.42mL浓盐酸，定容至10mL，高温高压灭菌后，室温保存。
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
质粒小提
质粒小提（这里试剂盒没有柱平衡步骤）：
1、大离心管4000rpm离心5min，吸除上清；
2、每5ml菌液、加入250μlP2，上下颠倒6-8次，温和，＜5min；
4、加入350μlP3，上下颠倒6-8次，温和；12000rpm离心10min；
5、取上清，加到柱子里，12000rpm离心2min，弃废液；
6、加入去蛋白液HB 500μl，12000rpm离心1min，弃废液；
7、加入75%乙醇700μl，12000rpm离心1min，弃废液；
8、重复上一步；
9、空离一次，12000rpm离心2min，弃收集管；
10、晾干；
11、加ddH2O溶解，放2min，12000rpm离心2min。
注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入250μl溶液P1（先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质粒提取详解
碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。
这个实验我们没有做过，但QIAGEN抽提大质粒用的就是碱裂解法。
【质粒抽提的8大窍门】1：摇菌时间-过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。
如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。
2：起始菌体量-大家习惯说“从多少ml菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。
3：菌体的彻底悬浮-如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。
这个团块在溶液III加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。
4：使用相对过量的试剂-这是适合所有核酸抽提的建议。
试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。
如果认为这样不经济，就少用一点菌体。
5：裂解时间-加入溶液II后，混匀，体系最好能立即变得清澈。
体系如果变得清澈了，马上加入溶液III中和。
如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。
如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。
6：中和的操作-在 1.5ml离心管中加入溶液III后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。
效果非常好。
7：中和后的离心去蛋白-一定要将蛋白质彻底离心下去。
如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。
【降低RNA残留的方法】RNA的去除，首先是使用RNase消化。
在溶液I中加入高浓度的RNase A(100ug/ml)，或者用含25ug RNase A/ml TE溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA残留，但都不能彻底去除。
质-粒-提-取-原理及步骤
质-粒-提-取-原理及步骤概述质粒提取，又称DNA提取，是一种分离和提取所需DNA的过程。
质粒提取在许多实验中都是非常重要的步骤，例如基因工程、分子生物学、遗传学和其他DNA相关实验。
本文将介绍质粒提取的原理及步骤。
原理DNA提取的过程通常包括细胞破碎、DNA纯化、DNA溶解和复性等步骤。
对于质粒提取，主要步骤通常包括以下内容：1.细菌培养：在质粒提取之前，需要将细菌培养在含有适当抗生素的培养基中，用于扩增质粒数量。
2.细胞破碎：使细胞破裂以释放出含有质粒的细胞内物质，此步骤需要进行严格的抗污染措施，以避免污染质粒样本。
3.除去污染物：除去细胞壁、蛋白质、核酸和其他污染物。
4.离心分离：将上述步骤中提取出的样本进行离心分离，使DNA沉淀，以便进一步纯化。
5.溶解：通过加入一定的缓冲液或去离子水，使DNA重新溶解。
步骤以下是一种常见的质粒提取步骤：1.处理样本：将含有所需质粒的细胞收集，并进行初始处理，包括细胞壁破裂、核酸纤维溶解等。
2.傅里叶纯化：通过傅里叶变换纯化，将细胞内杂质和有机污染物清除。
3.离心分离：将细胞样本离心，使DNA沉淀到底部，并且将上层样本移除。
4.乙醇沉淀：加入乙醇沉淀，将DNA纯化到上清液。
5.重振溶解：最后使用适当缓冲液重振重振溶解DNA，也可以使用去离子水重振。
以上就是质粒提取的原理和步骤，这是一个非常重要的操作，在DNA研究和实验中有着广泛的应用。
我们需要注意的是，在操作过程中需要进行高标准的质量控制，以确保实验结果的准确性。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,缍钥股氐目剐缘取质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed cont rol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%.第二节利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。
质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
第三节质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DN A片段；（4）具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR32 2、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Coval ently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。
在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。
如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。
当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
第二节材料、设备及试剂一、材料含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株,1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。
二、设备微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机,恒温振荡摇床, 高压蒸汽消毒器(灭菌锅), 涡旋振荡器, 电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
三、试剂LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g,NaCl 10 g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。
溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-2 0℃,每一小份一经使用后便予丢弃。
3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至10 0ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。
溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释),1％SDS。
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml,冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml,定容至100ml, 并高压灭菌。
溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml 的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。
冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。
重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0. 5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。
酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。
TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0)。
高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
STET：0.1 mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100。
STE：0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0)。
电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液(5×)：称取Tris 54g,硼酸27.5g,并加入0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至1000ml。
（2）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝,40% (w/v) 蔗糖水溶液。
第三节操作步骤一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。
用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。
二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。
这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
（一）、煮沸法将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
取20ml进行电泳检查。
[注意]对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。
（二）、碱法取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。
加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。
加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟, 4℃下12000g离心5-10分钟。
上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。
将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟,然后4℃下12000g离心10分钟。