细胞内细胞因子染色法07
FACS 胞内染色教程文件
流式胞内染色实验方法方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。
不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色实验材料：12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。
实验流程：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。
缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。
斡旋分散细胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。
室温避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
细胞因子染色方案(中)
胞内细胞因子染色1.细胞刺激完成后，移去大部分上清液，加200ulFACS或MACS buffer，轻轻混匀。
设计细胞染色的排放位置并记录，根据设计把细胞转移至染色板里，2000rpm,离心2min，甩去上清，在吸水纸上轻轻拍干，使用的位置不可重复利用(下同)。
2.死细胞染色。
加200ul PBS，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min；重复洗涤1次。
此步骤的目的为洗去培养基中残留的蛋白质。
Dead/Live dye (Violet (BV421 channel), Aqua (BV510 channel), or Zombie Yellow (BV570 channel)用PBS 1:1000稀释，每孔加50 ul，轻轻混匀，避光，室温染色30 min。
然后每孔加200ulFACS buffer，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min。
3.表面染色。
A.配制表面染色抗体mix。
根据染色方案计算每个抗体加入量，将抗体按照既定的稀释比例溶于FACS buffer里，每个抗体加过后需标记，防止加错。
使用前吹打混匀。
B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。
避光，人细胞室温染色15min；小鼠细胞4℃染色10min。
C.染色后，洗去未结合的多余抗体。
加入200ul FACS buffer 轻轻吹打，2000rpm, 2min离心，甩去上清。
D.如果使用Biotin偶联的抗体，配制Streptavidin-dye至工作浓度。
每孔50ul,轻轻吹打后，4℃避光染色10min。
染色结束后加FACS buffer 200ul,2000rpm, 2min离心，甩去上清。
4.固定破膜。
（BD）A.每孔加入50ul固定破膜液(BD CytoFix/Perm)，轻轻吹打混匀。
避光固定破膜4℃，20min。
B.配制Perm Wash。
10X浓缩液稀释为1X，即1份浓缩液加9份灭菌水。
C.固定破膜完成后，洗涤2次。
细胞内染色的操作步骤
细胞内染色的操作步骤1.准备试剂：•抗凝全血或待测细胞（每测试1×106个细胞）•荧光标记单克隆抗体•FACS溶血素（FACS Lysing Solution，10×）。
使用时，用去离子水1:9稀释为1× FACS溶血素•FACS破膜剂（FACS Permealilizing Solution，10×）。
使用时，用去离子水1:9稀释为1× FACS破膜剂•洗液：含有0.5% BSA和0.1% NaN3的PBS缓冲液•固定液：含有1%多聚甲醛的PBS缓冲液2.试验用具：•12×75 mm FALCON管•涡旋混匀器•离心机•FACS流式细胞仪3.染色步骤：1)12×75 mm FALCON管顺序编号；2)各管加入适量细胞表面标志的荧光标记单克隆抗体（用量见试剂说明书），做细胞表面标记；3)各管加入50 μL—100 μL抗凝全血或1×106个细胞，充分混匀，室温避光反应15—30分钟；4)加入2 mL 1× FACS溶血素溶解红细胞，充分混匀，室温避光反应10分钟；5)500×g离心5分钟，弃上清；6)加入0.5 mL 1× FACS破膜剂细胞打孔，充分混匀，室温避光反应10分钟；7)加入2—3 mL洗液，充分混匀，500×g离心5分钟，弃上清；8)各管加入适量细胞内标志的荧光标记单克隆抗体（用量见试剂说明书），做细胞胞内分析物的标记；9)胞内抗体与细胞充分混匀，室温避光反应30分钟；10)加入2—3 mL洗液，充分混匀，500×g离心5分钟，弃上清；11)各管加入500 μL固定液重悬细胞；12)上流式细胞仪分析。
上机前，样本可4°C避光保存24小时。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
细胞因子检测方法
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细胞培养和刺激的基本方法
人IFN-γ：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时
人TNF-α：使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激６小时
人IL-2：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时
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mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
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小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
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免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
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ELISPOT
Enzyme-linked Immunospot Assay
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ELISPOT发展历史
1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。
快速 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
医学知识之细胞染色
细胞染色一).瑞特(Wright)染色法：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。
血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。
目前常用瑞特染色法。
(1)瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。
亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。
通常为氯盐，即氯化美蓝。
美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。
市售美蓝中部分已被氧化为天青。
伊红通常为钠盐。
即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。
(2)细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。
因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质;细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
(3)PH对细胞染色有影响。
细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红;在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。
因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。
配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。
新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。
EAM GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。
rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl(视染液浓度而定)，加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。
Ra=a6 50/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm ;天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂I. 抗体1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替II. 其他材料：1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)5. Ionomycin (Sigma I9657)仪器1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)步骤1. 刺激细胞：1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。
（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）2. 收集细胞:1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞2) 收集细胞用PBS.重悬两次3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋3. 细胞表面抗原染色1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。
免疫学方法测定细胞因子
免疫学方法测定细胞因子免疫学方法是一种用于测定细胞因子含量和活性的重要手段。
细胞因子是一类分泌蛋白质，对于调节和协调免疫反应非常重要。
免疫学方法可以通过测定细胞因子的浓度来评估免疫反应的状态，从而对免疫功能进行分析和研究。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、流式细胞术和免疫组织化学等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
首先是ELISA。
ELISA是一种非常常见的免疫学方法，可以测定细胞因子的浓度。
该方法利用对特异性抗体的相互作用来检测目标物质。
通常情况下，可以使用针对目标细胞因子的特异性抗体来修饰可溶性蛋白或固定在基质上，形成检测物的捕获体。
然后，添加细胞因子样品，通过特异性抗体的结合来测定目标物质的浓度。
最后，可以使用一种辅助检测物质，如酶标记抗体或荧光标记抗体，来标记抗原抗体复合物，从而通过测定检测物质与辅助检测物质之间的相互作用来分析细胞因子的浓度。
其次是流式细胞术。
流式细胞术是一种广泛应用于细胞学研究的技术。
通过使用荧光标记的抗体或荧光标记的细胞因子，可以在单个细胞水平上分析细胞因子的表达和活性。
流式细胞术可以直接测定细胞因子的含量，也可以通过测定细胞因子与特异性抗体的结合来分析细胞因子的活性。
此外，流式细胞术还可以用于分析不同细胞中细胞因子的表达差异。
最后是免疫组织化学。
免疫组织化学是一种病理学研究中常用的方法，可以分析细胞因子在组织和器官中的分布和表达。
免疫组织化学利用特异性抗体与目标分子结合的原理，通过对组织进行染色来分析细胞因子的位置和数量。
该方法可以通过显微镜观察并定量细胞因子的表达情况，从而研究细胞因子在免疫反应中的作用。
总结起来，免疫学方法是一类重要的实验手段，可以用于测定细胞因子的含量和活性。
在免疫学研究中，ELISA、流式细胞术和免疫组织化学是常用的免疫学方法。
这些方法可以提供有关细胞因子在免疫反应中的角色和机制的重要信息，对于了解免疫功能的调节和疾病发生发展具有重要意义。
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方法特点
1. 单细胞水平计数 简单、快捷、 2. 简单、快捷、灵敏 3. 实验结果客观
实验过程
取淋巴细胞，刺激剂作用， ℃孵育1小时 取淋巴细胞，刺激剂作用，37℃孵育 小时 加入BFA继续培养 小时，用PBS洗涤。 继续培养5小时 洗涤。 加入 继续培养 小时， 洗涤 4%多聚甲醛室温固定 分钟后，PBS洗涤。 多聚甲醛室温固定8分钟后， 洗涤。 多聚甲醛室温固定 分钟后 洗涤
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
激发光源与荧光标记物
前向角散射光信号
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光信号
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4)
检测信号
双参数点图
标本制备
标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300 目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标 10 /ml-外周血白细胞计数， 本需PBS PBS稀释 本需PBS稀释 抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检 测。 溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度：26~27ºC，室温避光。 室温避光。
流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM） ， ）
对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进 行多参数的快速的定量和分析的技术。
检测仪器：流 检测仪器 流 式 细 胞 记 数 仪
FCM结构组成部分
液流系统; 液流系统;
–
将细胞引导至检测位点
光学系统; 光学系统;
– 产生并收集光学信号
电子系统; 电子系统;
细胞内细胞因子染色法
中山医学院免疫学教研室
实验原理
细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA， 细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生 BFA 细胞因子滞留在细胞内； 细胞因子滞留在细胞内； 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内， 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并 可以检测相应细胞因子； 可以检测相应细胞因子； 流式细胞记数技术可以记数细胞， 流式细胞记数技术可以记数细胞，分析 相应细胞的质和量。 相应细胞的质和量。
– 将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分 将光信号转换成电信号,使之数字化,
析。
细胞分选系统。 细胞分选系统。
FLOW CELL(流动室 流动室) 流动室
Injector Tip
鞘液
荧光信号
聚焦的激光光束
荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后 会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定 的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测) 这些光学信号
结果示范
1.56
0.25
8.23
0.26
左图显示在抗原刺激前， 细胞中能产生IFN-γ的细胞占 的细胞占PBMC的 左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生 和 细胞中能产生 的细胞占 的 0.25%和1.56% 和 右图显示在抗原刺激后， 细胞中能产生IFN-γ的增加到 的增加到8.23%，提示该 右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生 细胞中能产生 的增加到 ， 抗原能促进CD4-细胞分泌 细胞分泌IFN-γ 抗原能促进 细胞分泌
重悬细胞， ℃放置几小时或过夜。 重悬细胞， 4℃放置几小时或过夜 加入荧光标记抗体, ℃避光30分钟 洗涤。 分钟， 加入荧光标记抗体 4℃避光 分钟，洗涤 缓冲液2重悬，流式细胞记数仪检测。 缓冲液 重悬，流式细胞记数仪检测。 重悬BS 1升（洗细胞用） × 升 洗细胞用） 2. PBS +0.1%BSA+NaN3 0.05% 500ml(用于 用于 染色后FACS前) 染色后 前 3. PBS+BSA+NaN3 +0.1%Saponin 250ml(封 封 闭染色后用) 闭染色后用 4. PBS +BSA+NaN3+Saponin+5%milk 40ml