胞内流式检测参考因素
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展
流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。
因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。
随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。
本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。
【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。
细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。
而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。
相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。
一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。
流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。
流式细胞报告单参考值
流式细胞报告单参考值流式细胞报告单是临床医学中常用的一种检测手段，用于分析和诊断疾病。
流式细胞测定技术是用于检查血液、骨髓、淋巴结、脾脏等样品中的细胞组成和数量的一种分析方法。
在流式细胞测定中，细胞样品经过特殊处理后，通过流过一系列光学器件的高速水平线流柱而被分离、分析、计数和分类，最终得出细胞类型和相应的数量。
概述1. 标本信息（样本号、姓名、性别、年龄、检测时间、医院、科室、医师）；2. 细胞分析结果（白细胞计数、百分比、细胞计数）；3. 表面标记结果；4. 细胞染色体分析（如骨髓细胞分析）。
细胞分析结果1. 白细胞计数（单位：×10^9/L）：正常值范围：成年男性：4.0-10.0×10^9/L参考值：低于正常值范围：百叶片样细胞增多、骨髓抑制、炎症、药物影响等。
高于正常值范围：感染症、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等。
2. 百分比：百叶片样细胞：0-5%淋巴细胞：20-40%嗜碱性粒细胞：1-3%百叶片样细胞增多：过敏性疾病、传染性疾病、某些药物影响等。
嗜酸性粒细胞增多：过敏性疾病、寄生虫感染等。
淋巴细胞增多：感染症、慢性淋巴细胞白血病等。
嗜碱性粒细胞增多：特发性嗜碱性粒细胞增多症等。
1. CD45：白细胞常见的细胞表面分子，用于区分淋巴细胞、单核细胞和其他细胞。
2. CD19：B细胞的特定标记。
细胞染色体分析是一种用于分析染色体的流式细胞测定技术。
它是通过在细胞中利用染色体取样来确定染色体的组成和结构。
细胞染色体分析在诊断生殖异常、癌症、细胞遗传病和先天性畸形等方面发挥着重要作用。
流式细胞报告单中的细胞染色体分析通常包括：1. 骨髓细胞分析：它是一种检查骨髓细胞中染色体的分析方法，可帮助确诊白血病、骨髓增生异常综合征等血液疾病。
2. 染色体核型分析：它是一种检查染色体组成的分析方法，也就是确定染色体数量和结构的分析方法。
它常用于分析先天性染色体畸变和癌症等病症。
流式细胞检测内容
流式细胞检测内容
流式细胞检测是一种用于分析单个细胞的技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞检测可以提供关于细胞的多个参数的信息，包括形态、大小、表面标记物的表达水平和分布、细胞周期状态等等。
流式细胞检测的内容主要包括以下几个方面：
1. 细胞计数和活力分析：通过测量细胞数量来评估样品中细胞的浓度，并通过活细胞染色来分析细胞的存活率。
2. 表面标记物分析：利用荧光标记的抗体或其他可特异性结合到细胞表面的分子来分析细胞表面标记物的表达水平和分布情况。
3. 细胞周期和DNA含量：通过核酸染色剂如荧光素染色剂或DNA特异性抗体来分析细胞的DNA含量、细胞周期和细胞增殖状态。
4. 免疫细胞功能分析：通过检测细胞的细胞因子分泌、胞外泌液和细胞内蛋白的表达来评估和分析细胞的免疫功能。
5. 细胞凋亡分析：通过核酸染色剂和特定的抗体来检测细胞凋亡的特征，如细胞核形态变化和磷酸化的蛋白质表达。
6. 细胞排序：根据细胞表面标记物的表达水平，可以使用流式细胞仪将特定类型的细胞分离、分选和收集。
通过对以上内容的分析，可以获得关于样品中细胞的多个参数和特性的信息，从而进行进一步的研究和分析。
流式细胞仪的参数
这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Hale Waihona Puke Fluorescence signals
Focused laser beam
excited electron ENERGY EMITS ENERGY AS LIGHT
ATOM
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长,
2. FCM在免疫学中的应用:
(1) 各种免疫细胞的表面标志, 细胞分选等; (2) 细胞内各种细胞因子的检测;
(3) HLA群体分型; (4) 细胞增殖 CFSE法：活体染料羧基荧光素酰乙酸 （Carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester， CFDA-SE）是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并 在细胞内被酯酶转化成具有绿色荧光的氨基反应性羧 基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）。CFSE只有当细胞 发生分裂时，才会平均地分配到子代细胞中。因此 CFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。
Schematic representation of the Annexin V assay
FCM分析细胞周期和凋亡: 根据细胞DNA含量的改变 凋亡细胞DNA的降解,凋亡的细胞因核酸内切酶 的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小 片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋 亡细胞的DNA含量相对减少，与荧光染料的结合 减少,故细胞DNA荧光强度降低;DNA直方图上显示 在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或 称亚G0/G1峰, 又称凋亡峰.通过DNA含量可同时 研究凋亡细胞的周期特异性。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
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滤光片
分色反光镜
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PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
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数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
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量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
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经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
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液流系统形成单 个细胞流示意图
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光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
流式检测细胞内钙离子
用Furo-3/AM检测细胞内钙离子浓度FSC forward scatter 480nmSSC side scatter 480nmFL1 515-545nm 绿色FL2 564-606nm 橙色FL3 650- 红色1, 实验目的：检测不同细胞株中细胞质内钙离子浓度的差异，以检测钙离子浓度对癌细胞的迁移性的影响。
1，检测迁移性不同的FBJ-LL-H于S1-H 两株细胞中细胞内钙离子浓度的差异。
2，检测间质作用因子Stim1对细胞内钙离子浓度的影响包括对照组细胞，Stim1表达的几株单克隆细胞3，观察细胞ER钙离子释放之后的钙离子内流2, 样品处理：1.储备液配制F-127 5mg + 25uL DMSO 终浓度20%0.05mg Fluo-3/AM +22uL DMSOF127与Fluo-3/AM 以体积比1比1混合终浓度为2 μM2. 消化细胞3*10e6/mL-1*10e7/mL 细胞混悬液加入Fluo-3/AM，使之终浓度为4 μM3. 避光37℃45min4. PBS(-)清洗2遍5. 用PBS(-)重悬细胞，将浓度定为1*10e6/mL6. 当用毒胡萝卜素Thapsigargin（TG）排空细胞内质网钙池钙离子时, 用终浓度为3 μM的TG 孵育15min，上样20 s后加入钙离子使其终浓度为1 μM观察钙离子内流7, 为观察细胞在加入TG之后胞内钙离子的变化，将未经TG处理的细胞上样20s后加入TG观察钙离子浓度变化，正常情况下TG加入后因为钙池钙离子的释放胞内钙离子浓度会有一个上升的过程，随后因为钙泵失效，钙离子会逐渐降低。
流式细胞仪Coulter图·横轴时间time纵轴荧光强度（FL1）（40-秒baseline monitoring？）上样持续检测1-3min 激发光波长488nm 发取400uL混悬液，射波长530nm数据处理CellQuest software实验原理：Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm 波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。
流式胞内细胞因子检测
流式胞内细胞因子检测流式胞内细胞因子检测是一种用于研究细胞因子在单个细胞水平上的表达和分泌的技术。
细胞因子是一类产生于免疫细胞和其他细胞类型中的小分子蛋白质，对于细胞的发育、增殖、分化和功能调节具有重要作用。
流式胞内细胞因子检测可以帮助科研人员了解细胞因子的表达模式、功能和调控机制，从而深入研究细胞免疫学、炎症反应、感染和免疫相关疾病等领域。
流式胞内细胞因子检测的原理是利用单克隆抗体与特定细胞因子结合，然后使用荧光标记的二抗检测这种结合。
首先，需要选取合适的抗体对细胞因子进行检测。
抗体通常选择单克隆抗体，因为其高度特异性和亲和性。
对于胞内细胞因子的检测，首先需要破坏细胞膜，使细胞内的细胞因子释放到胞外液中。
一般来说，可以通过细胞固定和渗透化处理来实现这一步骤。
接着，使用标记有荧光染料的二抗与细胞因子结合，产生荧光信号。
最后，使用流式细胞仪对细胞进行分析，并得到细胞因子的表达和分泌水平。
流式胞内细胞因子检测的优势之一是可以在单个细胞水平上进行分析。
通过研究单个细胞的细胞因子表达水平，可以得到更准确、具体的结果，避免了整体细胞群体的平均值的混淆。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以同时分析多种不同细胞因子的表达和分泌水平，可以全面了解细胞因子的调控网络。
另外，流式胞内细胞因子检测还具有高灵敏度和高速度的特点，可以快速得到结果，并且对于微量样品的检测也有很好的表现。
流式胞内细胞因子检测在多个研究领域发挥了重要作用。
在免疫学领域，可以通过检测不同类型免疫细胞中细胞因子的表达水平，了解它们在免疫应答中的作用和调控机制。
在炎症反应研究中，可以检测炎症细胞中细胞因子的表达水平，从而了解炎症反应的机制，并寻找调控炎症的目标。
此外，流式胞内细胞因子检测还可以应用于感染和免疫相关疾病的研究，帮助科研人员了解疾病的发病机制和炎症信号通路。
然而，流式胞内细胞因子检测也存在一些局限性和挑战。
首先，流式胞内细胞因子检测需要选择合适的抗体对特定细胞因子进行检测。
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流式细胞术胞内因子检测的关键控制因素
前言：
由于胞内分析步骤复杂，涉及变异因素多，可能会出现结果不稳定，较难重复等问题。
我们提出这些分析关键因素，希望能帮助大家排除实验过程中一些问题，这些控制因素不仅适用于细胞因子分析，也可扩展到其他细胞生物学研究领域，如胞内信号传导，凋亡等。
1、刺激与收获细胞
许多胞内与胞外蛋白的表达的调控都与细胞激活有关，细胞因子更为突出，因为通常情况下，未刺激的白细胞不表达细胞因子或表达量极微无法检测，研究者必须采用体外激活以刺激细胞因子的表达。
多克隆激活剂可以诱导多种细胞因子分泌细胞，这些细胞经荧光染色可在流式细胞仪上定群检出。
使用蛋白转运抑制剂至关重要因为它有助于细胞因子聚集，提高检出率。
每个研究者都应根据实验系统慎重选择激活方法（刺激剂类型、反应时间曲线等）。
●蛋白转运抑制剂的选择
蛋白转运抑制剂可以通过增强胞内细胞因子聚集因而使胞内染色信号增强。
常用蛋白转运抑制剂有两种：
Monensin , 一种离子载体，可以破坏跨膜离子梯度。
Brefeldin A ，一种真菌代谢物，可以干扰囊泡自粗面内质网至高尔基体的转运。
研究者应依据研究目的选择适宜的蛋白转运抑制剂。
2、 Fc受体阻断
使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色。
在小鼠可以应用纯化的抗小鼠
CD16/32（Clone2.4G2）直接作用于FcγII/III受体。
在大鼠可以用纯化的抗大鼠CD32 直接作用于Fcγ受体。
在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
3、细胞表面荧光染色
特异的荧光标记抗体与细胞孵育标记细胞表面抗原,最好用含NaN 3及蛋白（FBS或BSA）的染色缓冲液稀释抗体。
可按 PBS+1%FBS+0.1%NaN 3 pH7.4，配制洗涤缓冲液。
4、细胞固定及通透
细胞胞内染色前必须固定通透，细胞通透同时或之前必须固定以保持细胞结构的完整性。
固定剂主要成分为多聚甲醛，通透剂主要成分为皂素。
这是两个比较重要的试剂，实验中最好设置阳性对照以验证这两个试剂的有效性。
5、荧光结合抗体胞内染色
胞内抗原染色取决于正确选用及确认与固定通透过程相容的特异性单抗，这些可供选择的单抗有多种形式，FITC，PE，APC，为研究者进行多色分析提供可能。
每一抗体都经过特殊测试确保其对胞内抗原染色最佳适于流式细胞分析。
胞内染色的质量极大程度取决于每个荧光标记抗体的最适反应浓度，应尽量选择预先滴定好的抗体以减少实验操作时间，保证细胞因子的有效
检测。
●荧光素的选择
会有最强荧光信号。
●检测相对低表达细胞因子（如 IL-4）时，应选用 PE 或 APC。
●单染某一细胞因子时最好也选用 PE 或 APC。
●同时染多种细胞因子时，弱表达的应选用 PE 或 APC。
FITC 标记最好用于高表达细胞因子（如TNF-α）。
◆抗细胞因子抗体滴度的调试
固定和通透后的细胞会出现与荧光抗体相关的较高的非特异染色，因此最好选用预先调试到适宜滴度的抗体进行胞内染色。
胞内染色抗体适宜滴度的变化范围很大，从 0.5μg/test 低至0.015μg/test。
6、胞内抗原染色对照
◆纯化抗体阻断对照
固定通透前，使用同种纯化抗体与细胞孵育后再用荧光标记抗体染色作为阻断对照以区分细胞因子特异性染色由于非特异背景染色。
我们发现 5.0μg/test 纯化抗体可以完全阻断细胞因子特异性染色。
◆重组细胞因子蛋白阻断对照
荧光标记细胞因子抗体染色前使用纯化重组细胞因子抗体可以阻断细胞因子染色，区分特异染色与背景染色。
我们发现 0.25μg/test 纯化重组抗体可以完全阻断细胞因子特异性染色。
注意，不是所有重组细胞因子蛋白都可以用于胞内染色阻断。
某些重组细胞因子会增加样本中所有细胞的非特异染色（如重组小鼠与人的 IL-12 [ p40 / p70 ] 和 IFN-γ），这种情况下最好采用两种以上细胞因子特异性抗体或其他对照（如比较激活与静止群体）以确定细胞因子的表达与检测相符。
◆荧光标记的同型对照
与特异性无关的荧光标记的 Ig 同型对照染色显示了特定荧光标记细胞因子抗体固有的非特异染色，可以作为阴性对照。
从抗细胞因子抗体染色中减去同型对照染色即可确定细胞因子阳性细胞百分数。
我们推荐使用与细胞因子抗体浓度相同的同型对照。
◆胞内细胞因子阳性对照
已知细胞因子阳性率细胞群体是非常有用的实验染色对照。
它可以确证染色过程及使用的细胞因子抗体的特异性。
此外还可用于调试实验细胞因子抗体染色/阻断的适宜浓度。
我们推荐实验中
每个要研究的细胞因子都采用对照群体，如果实验室自行制备对照细胞群体，应预筛其类型与细胞因子表达水平。
最好选用商品化试剂。