细胞因子的检测与应用CBA教程教案
560484人TH1TH2TH17细胞因子CBA分析试剂盒原理及方法
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FITC 阳性质控（E2）：FITC 标记抗体质控品，流式细胞仪调整仪器补偿 时使用。4C 保存，勿冷冻。 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品（C）：为人类细胞因子重组蛋白 冻干品。一瓶用 0.2mL 分析稀释液稀释，成为 10标准品（人 IL-2、IL-4、 IL-5 (Kit I)或 IL-6 (Kit II)、IL-10、TNF-、IFN-和 IL-17A 蛋白各含 50ng/mL）。4C 保存。 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品可以存放至有效期。复溶后的 10标 准品在 2-8C 保存，可存放 12 个小时。
156 156 156 156 156 156 156 156
80 80 80 80 80 80 80 80
40 40 40 40 40 40 40 40
20 20 20 20 20 20 20 20
2. Human TH1/TH2/TH17 细胞因子捕获微球混悬液的制备 捕获微球分为（A1）-（A7）七瓶，制备捕获微球混悬液之后应立即进行下 一步操作，加入 PE 信号抗体、标准品和待测样本。 1) 计算分析实验管数（包括标准品和质控品），例如分析 8 个待测样本，加 9 个标准管和 1 个阴性质控管，共计 18 管； 2) 充分摇匀各捕获微球试剂瓶（A1）-（A7）； 3) 每个测试需加入（A1）-（A7）捕获微球各 10L，制成捕获微球混悬液， 例如 18 管实验需要（A1）-（A7）捕获微球各 180L； 4) 如果是血清或血浆，先 300g 离心混匀的捕获微球，轻轻吸出上清，加入等 量的 H 富集血清，室温避光 30 分钟。
2
为了满足不同用户的实际需要，BD 公司 2005 年初推出了可以自由组合的 CBA Flex set。它改变了 CBA KIT 的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的自助餐。 CBA Flex set 的原理与 KIT 相似，捕获微球用来定性目的蛋白，检测抗体的荧光强 度来定量目的蛋白。与 KIT 不同的是，Flex set 微球是带有两种荧光，分别在流式 细胞仪的 FL3 和 FL4 通道检测，通过这两个二维矩阵来对捕获微球定性。PE 检测 抗体在 FL2 通道来对目的蛋白定量。(如下图)
【免疫学实验】流式CBA多因子检测详解
【免疫学实验】流式CBA多因⼦检测详解CBA原理详细介绍Cytometric Bead Array（CBA），即细胞因⼦微球检测技术。
是⼀种基于流式细胞检测系统的多重蛋⽩定量检测⽅法，它能够同时对单个样品中的多个指标进⾏检测。
BD公司利⽤流式细胞仪可对荧光信号进⾏级数放⼤的特性，将受检的可溶性因⼦附着于⼀些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因⼦进⾏检测。
CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利⽤微⼩、分散的颗粒捕获液体待测物，并利⽤流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从⽽测定待测物的数量。
详细原理介绍每个CBA微球⼤⼩⼀致，具有特定的荧光强度，包被有适⽤于特定分析（如其它抗体或者可溶性蛋⽩）的特异性捕获抗体（Capture Antibody），提供了类似ELISA孔板的捕获表⾯。
当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品（⾎清、⾎浆或者细胞培养液）中相应的抗原或蛋⽩结合，然后加⼊荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹⼼复合物。
最后通过流式细胞仪对特异性⽬的蛋⽩进⾏检测。
CBA的每种微球携带有不同强度的红⾊荧光，在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对⽬的蛋⽩定性；检测抗体带有PE荧光素标记，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度定量⽬的蛋⽩。
CBA技术特点CBA具有FCM的宽范围荧光检测特点，对样本需求量更少，检测更快速、更准确。
下⾯我们介绍⼀下CBA主要的技术特点: 1、轻松实现多重检测。
、轻松实现多重检测。
最多可同时对⼀个样本中的75个⽬的蛋⽩进⾏精确定量。
、样本需要量⼩。
仅需要50µL溶液就可进⾏⼀次检测。
2、样本需要量⼩。
、更⾼的灵敏度。
分析灵敏度⾼达2.8pg/mL。
3、更⾼的灵敏度。
4、更⾼的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。
CBA技术使蛋⽩定量的分析灵敏度⾼达pg/ml级别,检测范围达0-5000pg/ml，所有分析只需⼀组标准曲线。
临床免疫学细胞因子测定及应用
第十五章细胞因子测定及应用本章考点1.细胞因子的概述2.测定方法及应用细胞因子在机体的免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
检测这类因子不仅是基础免疫研究的有较手段，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。
第一节细胞因子的概述（一）概念细胞因子是由免疫细胞产生的一大类能在细胞问传递信息，具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。
（二）共同特性（1）化学性质大都为糖蛋白。
（2）细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。
（3）一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子。
（三）类型细胞因子分类按其作用大致可分为免疫调节因子和免疫调控因子两大类。
主要的细胞因子有：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化因子家族以及其他细胞因子等。
1.白细胞介素：白细胞介素（IL）是指免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子，名称后加阿拉伯数字以示区别。
现在已取得克隆化的基因、明确产物性质和活性的白细胞介素成员有15个IL在免疫细胞的成熟、活化、增生和免疫调节等一系列过程中均发生重要作用，此外IL还参与机体的多种生理及病理反应。
（1）IL-1、IL-2的性质及生物活性1）IL-1的性质：IL-1的产生细胞：几乎所有的有核细胞均可产生IL-1，主要以巨噬细胞为主，IL-1分子有IL-1α和IL-1β两种不同分子形式。
所有的有核细胞表面，都有IL-1受体（IL-1R），也分为IL-1R 和IL-2R两类。
IL-1的生物活性：局部免疫调节作用：①与抗原协同作用；②促进B细胞生长和分化及抗体形成；③促进单核-巨噬细胞等APC的抗原递呈能力；④与IL-2或干扰素协同增强NK细胞活性；⑤吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；⑥刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应。
全身性作用：①有较强的致热源作用；②对IL-1的生成具有反馈调节作用；③合成和分泌大量的急性蛋白；④使骨髓细胞库的中性粒细胞的释放和活化；⑤与CFS协同促进骨髓造血祖细胞的增殖能力。
细胞因子检测技术应用
细胞因子检测技术应用在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ ELISPOT ）。
作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。
由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自 ELISA，又突破传统 ELISA 法，是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：（1） ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
（2） ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。
细胞因子的检测和应用详解演示文稿
现在是15页\一共有41页\编辑于星期日
(4)细胞因子诱导的产物分析法
• 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性
物质，如IL-2诱导骨髓细胞合成组胺、IL6诱导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通过测 定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活 性
现在是13页\一共有41页\编辑于星期日
靶细胞滤液
3~5μm孔径的微孔滤膜
受检的趋化因子
３７℃ 温育数小时 取膜固定、干燥、着染、脱色
将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在 膜内通过距离，求其趋化单位
滤膜微孔小室法
现在是14页\一共有41页\编辑于星期日
趋化因子或待测 液
细胞悬液
对照培养液
琼 脂 糖 平 板 法 将含小牛血清的1%琼脂糖倾于平皿，如上图操作后经３７
现在是23页\一共有41页\编辑于星期日
实时荧光PCR技术
• 特点：实时（real time)测定 ，靶核酸扩
增和产物检测同时完成，扩增管在整个测定 过程中完全处于闭管状态，不容易出现扩增 产物对实验室的“污染”，对实验技术人员 的测定操作及实验室设置的要求都相 对要 低一些。
TaqMan技术
“分子信标”技术
自分泌（autocrine），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶 细胞或靶器官；
• 4）多样性：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也可产
生一种或几种相同的细胞因子。
• 5）网络性：协同效应；重叠效应；拮抗效应。 • 6）高效性：它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，
是免疫球蛋白等分子远不能及的 。
临床免疫学细胞因子测定及应用
第十五章细胞因子测定及应用本章考点1.细胞因子的概述2.测定方法及应用细胞因子在机体的免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
检测这类因子不仅是基础免疫研究的有较手段，亦是临床上探索疾病发病机制、判断预后和考核疗效的指标。
第一节细胞因子的概述（一）概念细胞因子是由免疫细胞产生的一大类能在细胞问传递信息，具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。
（二）共同特性（1）化学性质大都为糖蛋白。
（2）细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用。
（3）一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子。
（三）类型细胞因子分类按其作用大致可分为免疫调节因子和免疫调控因子两大类。
主要的细胞因子有：白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、转化因子家族以及其他细胞因子等。
1.白细胞介素：白细胞介素（IL）是指免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子，名称后加阿拉伯数字以示区别。
现在已取得克隆化的基因、明确产物性质和活性的白细胞介素成员有15个IL在免疫细胞的成熟、活化、增生和免疫调节等一系列过程中均发生重要作用，此外IL还参与机体的多种生理及病理反应。
（1）IL-1、IL-2的性质及生物活性1）IL-1的性质：IL-1的产生细胞：几乎所有的有核细胞均可产生IL-1，主要以巨噬细胞为主，IL-1分子有IL-1α和IL-1β两种不同分子形式。
所有的有核细胞表面，都有IL-1受体（IL-1R），也分为IL-1R 和IL-2R两类。
IL-1的生物活性：局部免疫调节作用：①与抗原协同作用；②促进B细胞生长和分化及抗体形成；③促进单核-巨噬细胞等APC的抗原递呈能力；④与IL-2或干扰素协同增强NK细胞活性；⑤吸引中性粒细胞，引起炎症介质释放；⑥刺激多种不同的间质细胞释放蛋白分解酶并产生一些效应。
全身性作用：①有较强的致热源作用；②对IL-1的生成具有反馈调节作用；③合成和分泌大量的急性蛋白；④使骨髓细胞库的中性粒细胞的释放和活化；⑤与CFS协同促进骨髓造血祖细胞的增殖能力。
细胞因子的临床应用培训课件
细胞因子的临床应用
3
一、粒细胞集落刺激因子
细胞因子的临床应用
4
在骨髓造血干细胞进பைடு நூலகம்分化、 增殖过程中，需要造血因子是集落 刺激因子（简称CSF)。包括： 粒细胞集落刺激因子、 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、 巨噬细胞集落刺激因、 白细胞介素3 等。
细胞因子的临床应用
5
G-CSF较特异地作用于粒细胞和 巨噬细胞的前驱细胞(简称CFUGM)。 ☆促进其增殖及分化， ☆增加中性粒细胞计数， ☆促进中性粒细胞游走、吞噬及 杀菌能力。
细胞因子的临床应用
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例如：应用干扰素后导致血细胞下 降，停用干扰素后24～72小时可 恢复，在如此短时间内恢复提示 可能存在白细胞在体内重新分布 有关。
一般应用干扰素后，外周血 象在部分病例有所下降，其程度 与剂量、疗效呈正相关。
细胞因子的临床应用
23
☆可引起血象下降剂量为每日每公
斤体重104～105单位以上。
细胞因子的临床应用
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干扰素的毒性和副作用
☆严重程度与剂量和用药次数相
关。
☆个体差异。 ☆自限性。
细胞因子的临床应用
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（一）小剂量干扰素可引起发热反 应，有时伴有轻度寒战和肌肉痛、 头痛、关节痛、疲劳感等，一般注 射后2～4小时出现，常见于首次用 药后。 （二）精神抑郁、嗜睡、健忘、偏 头痛。
细胞因子的临床应用
18
（4）巨噬细胞被激活，对肿瘤细胞 有细胞毒作用。 （5）调节主要组织相容复合物(MHC) 的抗原表达，调节T淋巴细胞对外来 抗原的识别。
细胞因子的临床应用
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干扰素对造血的影响 ☆干扰素能抑制髓系细胞集落形成、 B淋巴细胞的增殖以及髓系细胞的 分化； ☆干扰素能激活巨噬细胞、淋巴细 胞和自然杀伤细胞（NK细胞），刺 激产生白细胞介素（IL－1）。
细胞因子检测技术及其应用
一、细胞因子检测概述
一、细胞因子的类型与作用特点
二、细胞因子检测的特点与方法
细胞因子
由非神经—内分泌细胞产 生的一大类与免疫应答活动 密切相关的低分子蛋白与多 肽。
细胞因子的类型与作用特点
1、细胞因子的分类
2、细胞因子的作用特点
以生物学作用进行划分的分类
白细胞介素（Interleukin）—— IL-1、IL-2、…… IL-18 干扰素（Interferon）—— IFN-、IFN-、IFN- 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）—— TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor）—— M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）—— TGF-
显示检测结果
靶细胞的选择与培养
1、对所测的细胞因子有特异的敏感性 2、易培养、保存、生物学特性稳定 3、有良好的生长状态
4、种属适配
各类细胞因子检测的常用靶细胞
细胞因子 IL-1 实验系统 D10（M）增殖法 EL-4（M）增殖法 A352（H）增殖抑制法 IL-2 IL-3 CTLL（M）增殖法 KG-1（H）增殖法 IL-4 干扰因素 IL-2、IL-4 IL-4
二、细胞因子受体的检测
细胞因子受体的类型
膜型细胞因子受体
分泌型细胞因子受体
细胞因子受体的检测方法
膜型细胞因子受体的检测
配体检测法
抗体检测法
分泌型细胞因子受体的检测 标记抗体检测法
小结
细胞因子的检测技术发展较快 , 不断有新方法 出现 ,但是基本上都是利用其生物活性或免疫原性。 一方面由于待测生物样本中可能会存在细胞因子抗 体或相关分子、 可溶性细胞因子受体、 巨球蛋白 等干扰因素 , 另一方面 , 细胞因子的作用具有多向 性 ,其产生和作用受其他细胞因子的影响而增强或 抑制 , 每一种检测方法都有其优缺点和使用范围。 要想得到灵敏可靠的结果 , 一定要根据检测要求选 用合适的方法并严格控制测定条件 , 进行标准化的 检测。
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FL2 MFI FL2 MFI FL2 MFI
IL- 5
IL-10 10000
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Il-2 10000
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用
一个细胞的全面研究
Cell Vol. 132, January 25, 2008
什么是CBA?
CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分析 样本中多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA 微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性 抗体，提供了捕获表面，有效捕获待测蛋白，再加 入荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹 心复合物进行检测。
1000
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TNF-
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IFN-
1
1
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.26 B = 5.00 C =3.60 D = 3.89 R^2 = 0.9973
可检测的样本种类多样
各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组 织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
• 细胞大小 • 细胞颗粒度 • 细胞表面积 • 核浆比例 • DNA含量与细胞周
期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
• 多重分析 • 节约样本 • 灵敏度高
CBA原理
Capture Ab
+
Capture Bead
+
Analyze of Interest
Fluorescent Detector Ab- PE
一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，
与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。
CBA原理 +
Bead Intensity
Human Th1/Th2 Cytokine CBA –标准曲线
5000 pg/ml 2500 pg/ml 1250 pg/ml 625 pg/ml
IL-2
IL-4
312 pg/ml
80 pg/ml
20 pg/ml
IL-5
IL-2 IL-4 IL-5
FL2 MFI FL2 MFI FL2 MFI
IL-10IFN-g
TNF-a 10000
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1
1
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.29 B = 4.24 C =3.43 D = 4.33 R^2 = 0.9991
A = 1.31 B = 3.86 C =3.30 D = 4.45 R^2 = 0.9980
10
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10000
Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
细胞因子的检测与应用 暨BD CBA技术简介
苏州市跃亚生物技术有限公司 赵寅岗
流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快
速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个 细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。
A = 1.31 B = 3.77 C =3.37 D = 4.77 R^2 = 0.9997
10
1
1
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Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
IL- 10 10000
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1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0
10
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1
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10
100
1000
10000
Concentr ation (pg/m l)
Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logistic y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) +D
A = 1.34 B = 4.11 C =3.42 D = 4.45 R^2 = 0.9987
流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理
技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术 、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
BD Accuri C6
流式细胞术原理
流式细胞术流程
样本收集及处理 制备单细胞悬液 免疫荧光染色
上机检测 数据分析
流式细胞术检测样本
FL3 (670LP)
104
IL-8
103
IL-6
102
101
100 100 101 102 103 104 Detector Ab Intensity
FL2 (585/42BP)
BDTM CBA Kits
操作步骤
检测物与捕获微球共孵育 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记） 洗涤 流式细胞仪检测 CBA分析软件批量数据分析
A = 1.33 B = 4.08 C =3.24 D = 4.42 R^2 = 0.9987
CBA 分析软件
Home Screen
Toolbar Calibration entry screen
BD CBA Flex Set
• 基本原理与CBA kit相似 • 检测原理不同：
Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在 流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧 光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上 的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白， PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。