细胞因子染色方案(中)
细胞因子染色方案(英)
Intracellular cytokine staining1.After stimulation, remove the majority of the supernatant and add 200 ul FACS or MACSbuffer, mix gently. Then transfer the cells to staining plate, 2000 rpm, 2 min. Remove the supernatant and gently tap on papers.2.Dead/Live cell staining. Add 200 ul PBS, gently mix, 2000 rpm, 2 min; repeat once. Dilutethe Dead/Live dye (Violet (BV421 channel), Aqua (BV510 channel), or Zombie Yellow (BV570 channel) 1:1000 with PBS. Add 50 ul to each well, gently mix, protect from light, room temperature, 30 min. Add 200 ulFACS buffer, 2000 rpm, 2 min.3.Surface staining.A.Antibody cocktail preparation. According to the staining sheet, calculate the volume ofadded antibodies. Use FACS buffer to prepare the mixture and mark each antibody inthe sheet after adding. Gently mix the antibody cocktail.B.Add 50 ul antibody cocktail to each well and gently mix. Protect from light. For humancells, room temperature 15 min; for mouse cells, 4℃10min.C.Add 200ul FACS buffer, gently mix, 2000rpm, 2min, to remove supernatant.D.If biotin conjugated antibody is used, prepare Streptavidin-dye in FACS buffer. Add 50 ulto each well, gently mix, 4℃10min. Add 200ul FACS buffer, gently mix, 2000rpm, 2min.4.Fixation and permeabilization.（BD）A.Add 50 ulBD CytoFix/Perm buffer to each well. Gently mix, protect from light, 4℃，20min.B.Prepare “Perm Wash”. Use 1 part of stock buffer (10X) with 9 parts of sterilized water.C.Add 150 ul“Perm Wash” to each well, gently mix, 2000 rpm, 2 min. To wash once morewith 200ul “Perm Wash”.5.Intracellular staining.A.Prepare the antibody cocktail in “Perm Wash”, mark in the sheet after each adding. Mixgently before using.B.Add 50 ul antibody cocktail to each well and gently mix. Protect from light. 4℃30min.C.Add200ul “Perm Wash”, gently mix, 2000 rpm, 2 min. Wash once more with 200ul“Perm Wash”.D.If biotin conjugated antibody is used, prepare Streptavidin-dye in“Perm Wash” buffer.Add 50 ul to each well, gently mix. Protect from light. 4℃10min.Wash twice with“Perm Wash” as in the above.6.Filtration.A.Add 200ul FACS buffer to each well, gently mix.B.Filtrate the cell suspension to FACS tube. Adjust the volume based on cell numbers.Normally the total volume is 300-500 ul.Attentions：1.Mix the cell suspensions as gently as possible.2.The staining could be performed in EP tubes. For centrifugation, normally 500g, 2 min.3.For antibody cocktail preparation, the antibody box or tubes should be put on the ice. Usesterilized tips for each antibody. Antibody cocktail should be stored at4℃.。
细胞因子的检测方法
细胞因子的检测方法细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。
在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调整、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
细胞因子的检测不仅是基础免疫讨论的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观看、疗效推断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采纳的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来肯定的困难。
因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素。
目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类一.生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是依据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci 激造血细胞集落形成，IFN爱护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1．细胞增殖法很多细胞因子具有细胞生 zhang 因子活性，特殊是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生 zhang 、IL-3 ci 激肥大细胞生 zhang 、IL-6 ci 激浆细胞生 zhang 等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依靠于某种因子的细胞系，即依靠细胞株(简称依靠株)。
这些依靠株在通常状况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依靠株ctll-2在不含IL-2的培育基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外 zhang 期培育。
在肯定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖状况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依靠株外，还有一些短期培育的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂I. 抗体1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替II. 其他材料：1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)5. Ionomycin (Sigma I9657)仪器1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)步骤1. 刺激细胞：1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。
（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）2. 收集细胞:1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞2) 收集细胞用PBS.重悬两次3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋3. 细胞表面抗原染色1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂I. 抗体1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替II. 其他材料：1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)5. Ionomycin (Sigma I9657)仪器1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)步骤1. 刺激细胞：1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。
（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）2. 收集细胞:1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞2) 收集细胞用PBS.重悬两次3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋3. 细胞表面抗原染色1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。
细胞因子生物学活性检测
细胞因子生物学活性检测细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。
由于许多细胞因子cDNA 克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。
目前检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2维持活化T细胞的增殖，IFN能保护病毒对正常细胞的感染，TNF-α选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。
一、白细胞介素1(IK-1)生物学活性测定白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。
目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。
ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性(一) 原理小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。
根据加入IL-1后增殖水平(３H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。
(二) 操作步骤取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为1.5×10７／ml↓细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔培养板中加100μl(1.5×10６细胞)↓加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品100μl／孔(ConA终浓度为1.5μg／ml)↓37℃ CO２孵箱 66h每孔加３H-TdR 0.5μci孵箱 6h多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上↓烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数计算:1. 从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位2. 也可用刺激指数(SI)表示实验组cpmSI＝──────×100％对照组cpm(三) 试剂和器材1. 10％ FCS RPMI1640，96孔培养板，孵箱2. 标准IL-1，ConA3. ３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯4. 9999型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪5. β液闪计数仪(四) 注意事项1. 不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。
细胞染色方法大全
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。
细胞因子检测方法
细胞因子检测方法细胞因子是一类负责细胞之间相互通讯的蛋白质分子，在生物体中起着重要的调节和调控作用。
细胞因子检测是研究细胞因子功能及其相关疾病机制的重要手段。
本文将介绍常见的细胞因子检测方法，包括免疫学方法、PCR方法以及生物芯片技术。
免疫学方法是常用的细胞因子检测方法之一。
这种方法基于细胞因子与抗原抗体的特异性结合来进行检测。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫荧光法和免疫组化染色法等。
ELISA是最常用的细胞因子检测方法之一。
该方法利用酶标记的抗体与待测的细胞因子特异性结合，通过酶的催化作用使底物发生显色反应，从而进行定量测定。
ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较大的线性测定范围，广泛应用于临床实验室检测细胞因子水平。
免疫荧光法是通过荧光标记的抗体与待测的细胞因子结合，并通过荧光显微镜观察标记信号来进行检测。
该方法具有高灵敏度和高特异性，可以用于检测细胞因子的定位和分布，广泛应用于生物医学研究中。
免疫组化染色法是一种利用酶标记或荧光标记的抗体与待测的细胞因子结合，并利用酶的催化作用进行染色反应的方法。
通过染色的程度可以判断细胞因子的表达水平及分布情况。
这种方法常用于组织学研究和病理学鉴定中。
PCR方法是一种通过扩增特定DNA序列来进行细胞因子检测的方法。
该方法适用于细胞因子的基因表达研究。
常见的PCR技术包括逆转录PCR、实时荧光定量PCR和单细胞PCR等。
逆转录PCR是一种将RNA转录为cDNA并进行扩增的方法。
该方法通过反转录酶将RNA转录为cDNA，再利用DNA聚合酶扩增所得的cDNA，最终通过凝胶电泳或其它方法来检测细胞因子的基因表达水平。
实时荧光定量PCR是一种可以实时监测DNA扩增过程的PCR方法。
该方法基于荧光信号的累积产生来实时监测扩增产品的数量，从而测量初始模板的绝对量或相对量。
单细胞PCR是一种可以在单个细胞水平检测细胞因子基因表达的PCR方法。
该方法通过将单个细胞在微小反应体系中进行逆转录、扩增和检测，从而实现对细胞因子在单个细胞中的表达水平研究。
胞内因子染色 protocol
BD胞内因子染色操作流程本流程适用的固定破膜试剂盒：实验流程：A.刺激细胞：体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。
多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。
此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。
PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。
BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。
BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。
BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色1. 细胞培养用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。
细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。
在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。
在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。
随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
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胞内细胞因子染色
1.细胞刺激完成后，移去大部分上清液，加200ulFACS或MACS buffer，轻轻混匀。
设计细
胞染色的排放位置并记录，根据设计把细胞转移至染色板里，2000rpm,离心2min，甩去上清，在吸水纸上轻轻拍干，使用的位置不可重复利用(下同)。
2.死细胞染色。
加200ul PBS，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min；重复洗涤1次。
此步骤的
目的为洗去培养基中残留的蛋白质。
Dead/Live dye (Violet (BV421 channel), Aqua (BV510 channel), or Zombie Yellow (BV570 channel)用PBS 1:1000稀释，每孔加50 ul，轻轻混匀，避光，室温染色30 min。
然后每孔加200ulFACS buffer，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min。
3.表面染色。
A.配制表面染色抗体mix。
根据染色方案计算每个抗体加入量，将抗体按照既定的稀
释比例溶于FACS buffer里，每个抗体加过后需标记，防止加错。
使用前吹打混匀。
B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。
避光，人细胞室温染色15min；小鼠细胞
4℃染色10min。
C.染色后，洗去未结合的多余抗体。
加入200ul FACS buffer 轻轻吹打，2000rpm, 2min
离心，甩去上清。
D.如果使用Biotin偶联的抗体，配制Streptavidin-dye至工作浓度。
每孔50ul,轻轻吹打
后，4℃避光染色10min。
染色结束后加FACS buffer 200ul,2000rpm, 2min离心，甩去上清。
4.固定破膜。
（BD）
A.每孔加入50ul固定破膜液(BD CytoFix/Perm)，轻轻吹打混匀。
避光固定破膜4℃，
20min。
B.配制Perm Wash。
10X浓缩液稀释为1X，即1份浓缩液加9份灭菌水。
C.固定破膜完成后，洗涤2次。
第1次洗涤每孔加入150ul Perm Wash,轻轻吹打，
2000rpm, 2min离心，甩去上清；第2次洗涤每孔加入200ul Perm Wash，,轻轻吹打，2000rpm, 2min离心，甩去上清。
5.胞内染色。
A.配制胞内抗体mix。
抗体按既定稀释比例溶于Perm Wash里，使用前轻轻吹打混匀。
B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。
避光，4℃染色30min。
C.染色后，洗去未结合的多余抗体。
加入200ul Perm Wash轻轻吹打，2000rpm, 2min
离心，甩去上清。
共洗2次。
D.如果使用Biotin偶联的抗体，应用Perm Wash配制Streptavidin-dye。
每孔50ul,轻轻
吹打后，4℃避光染色10min。
染色结束后洗涤，Perm Wash 200ul,1500rpm,3min离心，甩去上清。
共洗2次。
6.重悬过滤。
A.每孔加入200ul FACS buffer，轻轻吹打重悬。
B.用40um滤膜过滤到FACS管里，视细胞量多少，体积可做适当调整，一般为300-500
ul。
注意事项：
1.操作过程中细胞吹打要轻柔。
2.染色也可于EP管内进行。
EP管离心500g, 2min。
3.抗体置于冰上，抗体mix配制时，注意用灭菌枪头，不要污染管内抗体。
配好后避光4℃
保存。