1 载体构建流程
目录
载体构建概念 01 02 载体构建原理
载体构建流程 03 载体构建拓展 05
04 载体构建结果
01
载体构建概念
Ø载体构建的概念
载体构建的概念
酶切
连接
酶切
转化
鉴定
载体构建：在基因工程中，将能进入细胞、在装载了外来的NA片段后仍能照样复 制的运载体称为载体，常用的载体是人工构建的质粒。载体构建即是构建含外源 DNA的质粒，将其导入到宿主细胞并能正常复制和表达的过程。
05
载体构建拓展
Ø载体构建新技术
载体构建新技术
片段1
同源臂 片段3
同源臂
片段2
片段1
外切酶，50℃
片段3
片段2
50℃退火，外切酶逐渐失活
片段1
片段3 50℃连接酶修补切口
片段2
片段1
片段3
片段2
无缝克隆：载体末端和引物末端具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个 与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿 主菌中的线性质粒(环状)依靠自身酶系将缺口修复。
目的条带
凝胶成像
电泳图
纯化PCR产物
目的条 带凝胶
含DNA 的结合液
离心
离心
离心
高纯度DNA
结合液60℃，
结合
10min
洗涤
洗脱
酶切与连接
AluⅠ
目的片段
BamHⅠ
目的片段
酶切
HaeⅢ
酶切
EcoRⅠ
平末端
粘性末端
22℃，T4 DNA 连接酶催化，连 接2h
转化与鉴定
取50μl感受态细 胞冰上解冻
加入5μl连接产物, 冰浴30min
42℃热激90s，冰 浴冷却1-2min
加入200μl LB，摇床 37℃/1h，200rpm/min
鉴定（菌落PCR/ 酶切鉴定/测序）
37℃恒温箱 培养过夜
涂平板
04
载体构建的结果
Ø载体构建结果分析
载体构建结果分析
菌落PCR
酶切鉴定
载体 目的片段
挑选单克隆进行菌落PCR检测，电泳结果可初步断定1、4、6、7、10为阳性克隆，酶切鉴定电泳结果 显示2、4、6在载体和目的片段大小位置处均有条带，符合预期即为阳性克隆。但要确定目的基因序列 完全正确，需要送去测序，只有测序正确才算成功构建载体。
PCR扩增目的基因
94
温
度 （
72
℃
） 55
预变性
1.高温 变性
2.低温 复性
3.适温 延伸
重复1-3步约30个循环
DNA变性形 成2条单链
目的基因片段扩增上百万倍
子链延伸DNA加倍
DNA单链与引物复性
22
DNA双链
1
2
3
4
5
时间（min）
琼脂糖凝胶电泳
-
+
缓冲液
上样
电泳方向
缓冲液
电泳
700bp 500bp
02
载体构建的原理
Ø载体构建原理
载体构建原理
限制酶酶切
DNA连接酶连接
转化
载体构建原理，是依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其他修饰酶的作用， 分别对目的基因和载体进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主 细胞，鉴定成功后，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
03
载体构建的流程
Ø扩增目的基因 Ø琼脂糖凝胶电泳 Ø纯化PCR产物 Ø酶切与连接 Ø转化与鉴定
载体构建新技术
EGFRvIII基因 P2A多顺反子元件 iRFP720基因
无缝克隆构建多顺反子表达载体
无缝克隆的优势：不受片段序列的限制、实现任意组装；可以同时无缝地拼接多个片段，节省时间。
载体构建新技术
无缝克隆的劣势：
T5外切酶 T5外切酶
1. 无法组装小片段
2. 黏性末端内部形成稳定的 二级结构（如发夹结构）
3. 长链黏性末端易随 机拼接错误
《载体的构建与鉴定》系列
载体构建流程
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
挑取阳性克隆去测序
测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的 点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间 的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表 达、结构、功能。 不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修 补。
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
连接
载体构建流程
载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
载体构建流程优秀课件
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。
本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。
质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。
在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。
2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。
在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。
3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。
常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。
PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。
在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。
常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。
连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。
2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。
3.连接酶在37℃下反应数小时。
4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。
转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。
转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。
常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。
载体构建的基本步骤
载体构建
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。
7、单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种。
载体构建流程
PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的 杂蛋白、离子等会造成酶切困难或星活 性，残余的聚合酶也会填平粘性末端， 造成克隆失败。
• 所以此步对整个分子克隆都至关重要， 可适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也 可以胶回收。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
• 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切， 切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切 低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要 求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐 浓度要求的。只要其中一种酶需要添加BSA， 则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会 影响任何内切酶的活性。
谢谢！
• 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免 出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积 的方法实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
• 通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切 产物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回 收酶切产物连接所得阳性克隆。
• 此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化 的目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序 列干扰。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
经典载体构建流程
载体构建的基本流程
载体构建的基本流程载体构建的基本流程主要包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。
首先，设计方案确定是载体构建的第一步，也是最为关键的一步。
在这个阶段，我们需要明确载体的功能要求、外形尺寸、结构布局等设计参数，然后进行方案设计和优化，最终确定最佳的设计方案。
设计方案的确定需要充分考虑载体的使用环境、工作条件、使用寿命等因素，确保设计方案的科学合理性和可行性。
接下来是材料准备环节，这一步是实现设计方案的关键环节。
根据设计方案确定的材料要求，我们需要选择合适的材料，并进行采购和准备工作。
在材料选择方面，需要考虑材料的力学性能、耐磨性、耐腐蚀性、导热性、导电性等多个方面的要求，确保选择的材料符合设计要求。
在材料准备工作中，还需要对材料进行切割、成型、加工等工艺处理，以满足设计方案的要求。
随后是工艺加工环节，这一步是将设计方案和准备好的材料转化为具体载体的关键环节。
在这个阶段，我们需要进行组装、焊接、切割、打磨、涂装等一系列工艺加工工序，将材料加工成符合设计要求的零部件，并进行组装装配，最终形成完整的载体。
工艺加工环节需要严格按照设计要求和工艺规程进行操作，确保加工质量和工艺精度。
最后是性能测试环节，这一步是验证载体构建结果的关键环节。
在这个阶段，我们需要对构建好的载体进行功能测试、性能测试、可靠性测试等一系列测试工作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。
在测试过程中，需要对载体的各项性能指标进行全面检测和评估，发现问题及时进行调整和改进，最终确保构建的载体达到预期的使用效果。
总的来说，载体构建的基本流程包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。
在实际的载体构建过程中，需要严格按照这个基本流程进行操作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。
同时，也需要不断改进和优化载体构建的技术方法和工艺流程，提高构建质量和效率，推动载体构建技术的发展和应用。
rnai载体构建的基本流程
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