Western免疫印迹方法
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤
活性蛋白整体方案免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
实验操作(一)配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。
3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后静置至胶凝固。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O活性蛋白整体方案冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
荧光Western免疫印迹方法（一抗稀释在脱脂奶粉中）
荧光Western免疫印迹方法（一抗稀释在脱脂奶粉中）做Western免疫印迹时，将膜孵育在用稀释的抗体中，4°C过夜并轻轻晃动。
抗体稀释在含5% w/v 脱脂奶粉的1X TBS, 0.1% Tween-20当中。
注意：双荧光Western中两种一抗需要是不同物种来源的，而且对应的二抗应标记有不同荧光。
如果两种抗体推荐使用的一抗稀释液不同，则将抗体在两种稀释液中分别测试，选用效果更好的稀释液用于双荧光实验。
A.所需溶液和试剂注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。
1. 1X磷酸盐缓冲生理盐水2. 1X SDS 上样缓冲液 (#7722, #7723):62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
3. 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇 (pH 8.5)。
10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。
4. 脱脂牛奶: (#9999)5. 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。
配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解。
6. 漂洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。
7. 抗体稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。
配20ml时，在18ml 水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。
8. 预染蛋白分子量标，宽谱（预混型）: (#7720)。
9. 印迹膜：本套方法为针对硝酸纤维素膜优化得到，CST推荐使用硝酸纤维素膜。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
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Western免疫印迹方法
所需溶液和试剂
注意：所有溶液用Milli-Q或相当级别的水配制。
1 20X 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS): (#9808) 配制1L 1X PBS时，取50ml 20X PBS用950ml RODI 水稀释到1L，混匀。
2 1X SDS 上样缓冲液(#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
3 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇(pH 8.5)。
10X Tris缓冲盐水(TBS): 配制1L时，称取24.2g Tris碱，80g NaCl加入1L水中；调整pH为7.6（稀释至1X使用）。
4 脱脂牛奶: (#9999) (重量体积比[w/v])
5 封闭液：含5% w/v脱脂奶粉，0.1% Tween-20的1X TBS。
配150ml时，在135ml水中兑入15ml 10X TBS，混匀；加入7.5g脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。
6 洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。
7 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA): (#9998).
8 一抗稀释液：含5% w/v脱脂奶粉或BSA，0.1% Tween-20的1X TBS。
配20ml时，在18ml 水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入1gBSA或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入20 μl Tween-20 (100%)，混匀。
做Western免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并4°C过夜。
10 预染蛋白分子量标准品，宽谱（预混型）: (#7720)。
11 印迹膜：本套方法在硝酸纤维素膜上优化过，CST推荐使用硝酸纤维素膜。
PVDF也可以用本方法。
蛋白印迹
样品制备的通用方法如下所述：
1 刺激细胞：加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。
2 吸去培养基。
用PBS清洗一次，吸去。
3 加入1X SDS样品缓冲液裂解细胞(6孔板中每孔加100 μl ，10cm盘中每盘加500 μl)
4 超声处理10–15秒打断DNA同时降低样品的粘度。
样本中加蛋白酶抑制剂或者磷酸酶抑制剂，样本需要保持新鲜。
使用磷酸化抗体时，建议使用CST 网站推荐阳性样本作为阳性对照
5 取20μl样品放在95–100°C加热5分钟，然后放在冰上冷却。
6 离心5分钟。
7 取20 μl加样到SDS-PAGE胶上(10 cm x 10 cm)。
注意：CST建议同时加上预染蛋白分子量标准品(#7720, 10 μl/泳道)以验证转膜成功，还有生物素标记的蛋白分子量标准品(#7727, 10 μl/泳道)用于判断目的条带分子大小。
8 将电泳后的蛋白电转移到硝酸纤维素膜或是PVDF膜上。
膜封闭和抗体孵育
注意：以下所用试剂体积数为10 cm x 10 cm (100 cm2)膜的用量。
使用不同大小的膜时，根据面积相应调整。
I．膜封闭
1（可选）转移后，室温下硝酸纤维素膜用25ml TBS清洗两次，每次5分钟。
2 将膜孵育在25 ml封闭液中，室温1小时。
3 用15 ml TBS/T清洗3次，每次5分钟。
II．一抗孵育
根据所用一抗，继续以下相应部分的操作。
一抗的dilution buffer 请看说明书（大部分是5%BSA，少部分是脱脂牛奶）
1 将抗体按说明书推荐浓度稀释在10 ml一抗稀释液中。
把膜孵育在一抗稀释液中4°C过夜并轻轻摇动。
使用时的稀释比例严格按照说明书不必改变，比如做WB 正常是1:1000，您不必用1:500或者其他稀释比例。
2 用15 ml TBS/T洗3次，每次5分钟。
3 按一抗来源选取合适的HRP偶联的二抗，将膜孵育于封闭剂稀释的二抗中（1：2000），同时加入HRP偶联的抗生物素二抗(#7075) (1:1000)以检测生物素偶联的蛋白质标准品。
室温1小时并轻轻摇动。
4 用1
5 ml TBS/T洗3次，每次5分钟。
5 继续D部分的检测步骤。
蛋白检测
1 配制10 ml LumiGLO®溶液，将0.5 ml 20X LumiGLO®，0.5 ml 20X Peroxide兑入9.0 ml Milli-Q 超纯水。
将膜浸入其中，室温下孵育1分钟并轻轻摇动。
注意：如果信号出现得太快，可以将LumiGLO®进一步稀释。
2 将膜取出并吸走多余的反应底物（但不要使它晾干），包在保鲜膜中然后压上x-光片曝光。
第一张胶片的曝光时间为10秒，从胶片上条带的强弱可以判断下一张胶片合适的曝光时间。
注意：由于检测反应的动力学特征，在LumiGLO®底物孵育后刚开始的信号是最强的，在随后的2个小时中，信号会不断衰减。