应用高分辨率熔解曲线检测MTHFR和MTRR基因多态性_潘登

（ 复旦大学生命科学学院遗传学研究所，上海 200433）
［摘 要］ 目的 探讨高分辨率熔解曲线（ HRM） 对单核苷酸多态性位点（ SNP） 检测的准确性，为新生儿出生缺陷相关基 因多态性的快速检测与治疗提供参考。方法 收集正常血样，抽取血液 DNA 并定量。设计亚甲基四氢叶酸还原酶（ MTH-
FR） 两个 SNP 位点 c． 677 C ＞ T 和 c． 1298 A ＞ C 和甲硫氨酸合成酶还原酶（ MTRR） 的一个 SNP 位点 c． 66 A ＞ G 的特异性 HRM
引物名称 C 677 T 1F C 677 T 1R C 677 T 2F A 1298C 1F A 1298C 1R A 1298C 2F A 66 G 1F A 66 G 1R A 66 G 2F
表 1 本研究所用的 HRM 及测序引物
引物序列 （ 5＇-3＇） GAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTG GCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCA TCATCTCTGGGGTCAGAAGC GGGAGGAGCTGACCAGTGAAG GGAGAACCAAACCGGAATGGTCACAAAGTG AGTTTGCATGCTTGTGGTTG ATGCTACACAGCAGGGACAG GCACAAAACGGTAAAATCCA GCATTGTTTCTTAAAGATTGAGG
倒 混 匀，加 入 400 μl 氯 仿 轻 摇 混 匀，接 着 室 温 12 000 rpm 离心 20 min，转移 600 μl 上清液至新的 洁净的 1． 5 ml EP 管中，加入等体积 － 20℃ 预冷的 异丙醇，混匀后 12 000 rpm 离心 15 min，倒掉上清 液，加入 75% 乙醇清洗、沉淀两次，室温晾干使乙 醇完全挥发，然后加入 100 μl 的灭菌双蒸水溶解。 经微量紫外可见分光光度计 （ NanoDrop 2000 Gene 公司） 测定 DNA 的纯度及含量，提取的 DNA 放置 于 － 20℃ 冰箱储存。
引物，利用 HRM 法对其进行检测，然后取部分样本测序，比较检测结果，并进行 HWE 检验。结果 经 HRM 法，96 例未知
基因型的样本中，MTHFR c． 677 C ＞ T 位点检测 61 例为 C / C 型，31 例为 C / T 型，4 例为 T / T 型； MTHFR c． 1298 A ＞ C 位点 检测出 50 例为 A / A 型，30 例为 A / C 型，16 例为 C / C 型； 对 MTRR c． 66 A ＞ G 位点检测出 51 例为 A / A 型，40 例为 A / G 型，
1． 2． 2 模板准备 将所有 DNA 样本用双蒸水稀释 至 10 ng / μl。
1． 2． 3 引 物 设 计 和 反 应 条 件 根 据 Genbank 上 MTHFR 基因序列，采用引物设计软件 Primer 5 设 计了 MTHFR 的两个 SNP 位点 c． 677 C ＞ T、c． 1298 A ＞ C 和 MTRR 一个位点 c． 66 A ＞ G 的特异性引物 以及测序引物，具体见表 1。所有引物均由上海生 工生物公司合成。将引物稀释至 10 μM 备用。
中国优生优育 2013 年 6 月第 19 卷第 3 期 Chinese Journal of Healthy Birth ＆ Child Care Vol． 19 No． 3 June 2013
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·论 著·
应用高分辨率熔解曲线检测 MTHFR 和 MTRR 基因多态性
潘 登，周芳芳，叶小娟，陈红岩，卢大儒
PAN Deng，ZHOU Fang-fang，YE Xiao-juan，CHEN Hong-yan，LU Da-ru （ Institutes of Genetics，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200433，China） ［ABSTRACT］ Objective This study aims to investigate the accuracy of the HRM for SNP detection，and provide evidence for the rapid detection of birth defects related gene polymorphisms and neonatal treatment． Methods A total of 96 plasma samples of healthy persons were included． DNA was extracted from blood and quantified． Specific high resolution melting analysis （ HRM） primers were designed． Polymorphisms including c． 677 C ＞ T and c． 1298 A ＞ C of Methylenetetrahydrofolate reductase （ MTHFR） gene，as well as c． 66 A ＞ G of Methionine synthase reductase （ MTRR） gene were detected by HRM and confirmed by direct sequencing． Results Among the 96 cases genotyped by HRM，there were 61 cases with C / C type，31 with C / T type and 4 with T / T type in MTHFR c． 677 C ＞ T site． In MTHFR c． 1298 A ＞ C site，there were 50 cases with A / A type，30 with A / C type，and 16 with C / C type． As for MTRR c． 66 A ＞ G site，there were 51 cases with A / A type，40 with A / G type，and 5 with G / G type． All these results by HRM were consistent with the sequencing results． Conclusion HRM can quickly and accurately detect birth defects related gene polymorphism，and it can be applied as an easy and highly effective method for clinical detection of genetic polymorphism． ［KEY WORDS］ high-resolution melting analysis； single nucleotide polymorphism； methylene tetrahydrofolate reductase； methionine synthase reductase
均与测序结果一致。结论 HRM 可快速准确且高通量地检测新生儿出生缺陷相关基因多态性，是一种简便和准确的可应
用于临床的检测方法。 ［关键词］ 高分辨率熔解曲线； 单核苷酸多态性位点； MTHFR 基因； MTRR 基因 ［中图分类号］ R394 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1007-3434（ 2013） 03-161-05
1 材料与方法
1． 1 样本 96 份 2011—2012 年上海市肺癌研究 项目中正常对照人群剩余血样，－ 80℃ 冻存。
1． 2 方法 1． 2． 1 血液 DNA 提取 取 250 μl 全血置于 1． 5 ml 离心管，加入 410 μl STE（ 10 mmol / L Tris-HCl； pH 8． 0； 1 mmol / L EDTA，pH 8． 0； 100 mmol / L NaCl） 缓冲液、90 μl 10% SDS 以 及 10 μl 蛋 白 酶 K 后 65℃ 水浴过夜，然后加入 300 μl 饱和 NaCl 轻轻颠
［通讯作者］ 卢大儒，E-mail： drlu@ fudan． edu． cn
碍，最终引起 DNA 甲基化水平异常，从而影响胚胎 的 正 常 发 育。 MTHFR 和 MTRR 多 态 性 与 乳 腺 癌［6］、结肠癌［7］、卵 巢 癌［8］、白 血 病［9］、不 孕 不 育［10］ 等多种疾病的发生发展密切相关。因此，我们需要 简单，快速，可靠，经济的方法对 MTHFR 和 MTRR 的多态性进行检测。目前已报道的单核苷酸多态性 位点（ single nucleotide polymorphism，SNP） 的检测方 法有多种，如 RFLP、荧光实时定量 PCR、Taqman 分 型、测序以及质谱等，他们各有优缺点，但总体来 说在高通量、快速和经济方面都不如高分辨率熔解 曲 线 分 析 方 法 （ high-resolution melting analysis， HRM） ，HRM 通过饱和染料对 PCR 产物的熔解曲 线变化进行实时监测，不需要使用针对目标位点的 特异性等位引物或探针，只需一对引物就可以对等
Detection of methylene － tetrahydrofolate reductase （ MTHFR） and methionine synthase reductase （ MTRR） gene polymorphism by high resolution melting analysis
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中国优生优育 2013 年 6 月第 19 卷第 3 期 Chinese Journal of Healthy Birth ＆ Child Care Vol． 19 N敏度高、特异性 强、简单快速、高效、经济，无污染，在 PCR 之后不 需要纯化分离，检测不受碱基位点的局限，还具有 高通量、闭 管 操 作 等 优 点。 本 研 究 利 用 HRM 对 MTHFR 和 MTRR 的 SNP 位点的检测，旨在为新生 儿出生缺陷相关基因多态性的快速检测与治疗提供 参考依据。