液相色谱-质谱联用技术及使用注意事项
液相色谱-质谱联用技术及应用
高效液相色谱-质谱（多级）联用技术及应用任三香（中山大学测试中心广州 510275）众所周知，色谱是一种分离复杂混合物的很好手段,而气相色谱-质谱联用仪由于它集分离与定性快速一气呵成及价廉的优点在应用范围广泛的分析检测行业中占质谱拥有量的50% 以上。
但是，气-质联用对样品的要求是来样必须在色谱柱能承受的温度下汽化，对于热不稳定的化合物及汽化不了的样品就得依靠其它分析手段来完成。
在攻克液相色谱与质谱联机接口技术后，应运生产的高效液相色谱-质谱（多级）联用仪作为90年代推出的商品仪器已逐步进入质谱界，并得到迅速发展，成为科研和诸多分析行业的有力工具，扩展了质谱仪分析化合物的范围，可谓当今质谱界最为新颖及活跃的领域。
本文将简要介绍高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry简称HPLC/MS）（包括多级即MS n）联机新技术及应用。
1 高效液相色谱-质谱（多级）联用技术高效液相色谱-质谱（多级）联用仪的在线使用首先要解决的问题是真空的匹配。
质谱工作需在高真空下完成，要与常压下工作的高效液相色谱（即大量流动相的涌入）-质谱接口相匹配并维持足够的真空，只能采取增大真空泵的抽速，分段、多级抽真空的方法，形成真空梯度来满足接口和质谱正常工作的要求。
现有的商品仪器多采用该方法。
在此主要介绍以下二种电离方式：1．电喷雾(Electrospray Ionisation简称 ESI)：其电离过程是“离子雾化”。
当样品溶液流出毛细管的瞬间，在加热温度、雾化气（N2）和强电场（3-5kV）的作用下溶剂迅速雾化并产生高电荷液滴。
随着液滴的挥发，电场增强，离子向表面移动并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。
通常小分子得到[M+H]+或[M-H]-单电荷离子。
而生物大分子产生Z>1的多电荷离子。
由于质谱仪测量的是质量电荷比（m/Z）。
液相色谱／质谱联用技术
液相色谱／质谱联用技术李立军色谱是快速灵敏分离有机物的有效手段，各种检测器中，除了应用最广泛的 FID（GC）和UV（LC）外，质谱（MS）尽管价格较昂贵，但是其选择性、灵敏度、分子量及结构信息等优势，已被公认为高级的通用型检测器，把它与各种分离手段联用，将定性、定量结果有机地结合在一起，一直是人们所研究的目标。
GC／MS在我国已有 20多年的应用历史，随着台式小型仪器迅速增长，在色谱研究中已经成为重要的手段，气相色谱质谱技术成熟运用至今，人们越来越不满足仅仅分析那些具有挥发性和低分子量的化合物，面对日益增加的大分子量（特别是蛋白，多肽等）和不挥发化合物的分析任务，迫切需要用液相色谱／质谱联用解决实际间题。
与气相色谱相比，液相色谱的分离能力有着不可比拟的优势，液相色谱／质谱联用技术为人们认识和改造自然提供了强有力的工具。
HPLC可以直接分离难挥发、大分子、强极性及热稳定性差的化合物，LC ／MS联机曾长期为分析界所期待，由于LC流动相与MS传统电离源的高真空难以相容，还要在温和的条件下使样品带上电荷而样品本身不分解，大量的样品不得不采取脱机方式 MS 鉴定，或制成衍生物用 GC／MS分析。
经过努力相继出现了多种液相色谱／质谱联用接口，实现了液相色谱／质谱的联用。
特别是大气压电离质谱（APIMS）的实现为 LC／MS的兼容创造了机会，商品化的小型 LC／MS作为成熟的常规分析仪器在九十年代已经在生物医药实验室发挥着重要的作用。
一．液相色谱／质谱联用适用范围液相色谱／质谱联用的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。
图1 液相色谱／质谱联用的基本流程首先看看气相色谱／质谱联用的特点：·要求样品气化后进入质谱仪·用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比·用毛细管色谱柱分离化合物，分高效率高·操作条件稳定、使用方法成熟·适宜分析小分子、易挥发、热稳定的化合物液相色谱／质谱联用主要可解决如下几方面的问题：①不挥发性化合物分析测定；②极性化合物的分析测定；③热不稳定化合物的分析测定；④大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）的分析测定；附图清楚地表明了各种接口技术的适用范围。
液相色谱质谱联用
a）超滤 b）溶剂萃取／去盐 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）净化／去盐 e）色谱分离 反相色谱分离 亲和技术分离 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化
1.固相萃取
固相萃取材料与柱色谱 中所用类似，要根据被分析物和 样品基质的性质，对于一般的有机物、带有烷基的疏水化 合物和非极性化合物可用C18、C8、C2 的非极性填料；对 于亲水化合物、胺类和含羟基化合物可用氰基和二醇等键 合的极性填料。对离子化合物可用离子交换树脂为填料。
（五）辅助气体流量和温度的选择
雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷 雾去溶剂的效果，碰撞气影响二级质谱的产生。 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气 体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物 的沸点20℃ 左右即可。对热不稳定性化合物，要 选用更低的温度以避免显著的分解。 选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的 组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和 流量小一点的。
工作原理：
放电针所产生的自由电子首先轰击空气中 氧气、氮气、水产生 O2+ N2+ NO+ H2+O等 初级离子，再由这些离子与样品分子进行 质子或电子交换而使其离子化并进入气相。
电喷雾（ESI）的特点
ห้องสมุดไป่ตู้
通常小分子得到 [M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或 [M-H]- 单电荷 离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测 定质/ 荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱 仪可测定质量数十几万的生物大分子。 电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离 子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定 的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析 蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压 控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。
液相色谱质谱仪安全操作及保养规程
液相色谱质谱仪安全操作及保养规程液相色谱质谱仪（LC-MS）是一种高档的分析仪器设备，其功能主要是将液相色谱与质谱相结合，能够对样品的组成及结构进行快速、准确的分析。
本文主要介绍液相色谱质谱仪的安全操作和保养规程，以确保仪器的顺畅运行和长期使用。
操作安全1.安全指南在使用液相色谱质谱仪之前，用户必须熟知仪器的安全指南，确保自己的安全和设备的安全。
安全指南通常包括以下内容：•工作场所应清洁、通风良好，无任何杂物；•操作前需要注意静电防护；•在操作过程中，用户应当严格遵守操作步骤，不要随意更改设备的工作状态；•操作过程中不要摆放任何易燃、易爆、有毒、有害物品；•已使用的化学试剂及设备必须正确处理。
2.实验室涉及的安全标识为保证实验室的安全，用户必须熟知实验室内涉及的安全标识。
液相色谱质谱仪实验室通常包括以下安全标识：•电源开关；•高压开关及指示灯；•消防灭火器及应急电话等。
保养规程1.日常维护•屏幕及键盘：每天用干净柔软的布擦拭，防止灰尘与污垢积累；•列管和积分器：应该定期清洗，以免样品残留而污染设备和传感器；•柱温箱：应该定期清洗，并且使用干的清洗布将柱温箱干燥，以免产生水分影响设备；•电脑主机：需要定期清理灰尘，以保持通风良好；•定期检查冷却水的水质和水量，以免反应器过热。
2.工作结束后的清理和保养•清洗并干燥积分器，以免样品残留影响使用；•清理槽内残留的试剂；•将标准品及样品浓缩得到的溶液和残留杂质处理掉，以免污染液相色谱质谱仪；•关闭电源等设备，避免设备过热及短路。
总结液相色谱质谱仪的安全操作和保养规程能够保证设备的顺畅运行，延长其使用寿命。
用户在使用设备之前，必须认真了解安全指南和实验室内涉及的安全标识，以确保自己的安全。
用户还必须按照规程进行日常维护，及时清理设备，确保设备的正常运行。
总之，正确的操作和日常维护，加上仪器的定期检查，都有助于仪器的长期安全运行。
液相色谱-质谱联用（LC-MS）使用指南及注意事项
液相⾊谱-质谱联⽤（LC-MS）使⽤指南及注意事项液相⾊谱-质谱联⽤（LC-MS）使⽤指南及注意事项⾼洁⽣物站A308 仪器型号: 岛津LCMS-20201.开机1.1 开机前准备确认氮⽓畅通，液氮罐GAS出⼝压⼒表指针在0.7~0.8MPa之间。
压⼒不够时，将其对⾯的增压阀拧⼤，使压⼒达到要求，若压⼒还不够，说明需要更换液氮。
确认流动相溶剂瓶内液体够⽤（流动相A-娃哈哈⼩瓶装纯净⽔，B为⼄腈，分别加千分之零点三五的HPLC级三氟⼄酸），液⾯要没过吸滤头。
打开UV检测器箱门，将三通与质谱分流接头连接。
1.2 开机过程开机顺序为1 2 3 4 5 6，关机顺序为6 5 4 3 2 1。
1.3 打开电脑之后打开分析程序。
将MS配置到程序中。
⽅法如下：Main→System Configuration→LCMS→上⽅蓝箭头→OK听到“滴”⼀声后，页⾯显⽰液相与质谱绿⾊ready状态，说明LC与MS均与程序连接良好。
2.1样品准备浓度：0.1 mg/ml 左右溶剂：流动相（⼄腈⽔甲醇），若以上均不溶，⽤少量DMSO溶解再稀释到以上溶剂中过滤膜！！样品瓶要确保⽆尘2.2仪器准备打开之前设定好的Method File→Download（⽬的是将仪器参数从程序配置到仪器） ?如果刚刚开机的话，各个部件还未预热，需要把各个部件打开。
打开顺序为：1234567（7打开后8和9⾃动打开）1）如果⽅法中的分⼦量扫描范围不是你需要的，重新设置：在下图中，Scan（+）Scan（-）分别为正负离⼦扫描设置。
扫描速度=扫描范围/ 扫描周期，扫描速度在1000u/second 左右⽐较好，所以改变扫描范围之后，要相应地改变扫描周期，使扫描速度在1000左右。
扫描范围为m/z 50-2000，⼀般设置100以上起始，因为溶剂中100以下⼩分⼦杂质较多，终⽌分⼦量⼀般为⽬标分⼦量的⼆倍稍⾼。
2）LC洗脱程序设置，设置⽅法与HPLC相似。
液相色谱-质谱联用仪的原理及应用
要点二
多组学分析
未来，液相色谱-质谱联用技术将更 多地应用于多组学分析，如代谢组学 、蛋白质组学等。这些分析需要高通 量、高灵敏度和高准确性的技术支持 ，为液相色谱-质谱联用技术的发展 提供了新的机遇。
要点三
临床医学应用
液相色谱-质谱联用技术在临床医学 领域的应用将不断增加，如疾病诊断 、药物代谢研究等。这些应用需要快 速、准确和可靠的分析方法，为液相 色谱-质谱联用技术的发展提供了新 的挑战和机遇。
更灵敏的检测器
质谱检测器的灵敏度不断提高，将使得液相色谱-质谱联用技术能 够检测到更低浓度的分析物，提高分析的准确性和可靠性。
自动化和智能化
随着自动化和人工智能技术的不断发展，液相色谱-质谱联用仪的 操作将更加简便，数据分析将更加快速和准确。
未来挑战与机遇分析
要点一
复杂样品分析
随着生命科学、环境科学等领域的不 断发展，对复杂样品的分析需求将不 断增加。液相色谱-质谱联用技术需 要不断提高分离效能和检测灵敏度， 以满足这些领域的需求。
广泛的应用领域
LC-MS在化学、生物、医学、环境等领域 中具有广泛的应用，如药物分析、代谢组 学、蛋白质组学、环境污染物分析等。
高灵敏度
质谱技术具有高灵敏度，可以对痕量组分 进行检测。
高通量
随着技术的发展，LC-MS已经实现了高通 量分析，可以同时处理多个样品。
宽检测范围
LC-MS可以检测多种类型的化合物，包括 极性、非极性、挥发性以及大分子化合物 等。
环境毒理学研究
通过液相色谱-质谱联用仪对环境中的有毒有害物质进行 分析，可研究其对生物体的毒性作用机制和生态风险。
生物医学领域应用
代谢组学研究
液相色谱-质谱联用仪可用于生物体液中代谢产物的定性和定量分析，从而揭示生物体 的代谢状态和疾病机制。
VARIAN 液相色谱色谱-质谱联用仪操作规程
VARIAN 液相色谱色谱-质谱联用仪操作规程
一、仪器准备
1.打开氮气确证压力为0.7MPa；打开氩气减压阀确证压力0.05MPa；
2. 打开液相色谱各个模块电源，打开电脑，双击桌面上的
Workstation Toolbar 图标，激活工作站工具栏；双击system
control进入仪器控制界面，等待联机和自检。
3. 开启真空泵，察看真空度，确保真空度达到1×10-6以上。
二、设定色相色谱、质谱条件
点击WorkStation 工具栏上View/Edit Methods 图标，编辑或激活一个采集方法，包括HPLC 参数和MS 相关参数，不同样品，该参数各不相同，具体包括：色谱柱(2.1×150mm,3μm，柱温，流速，进样量，流动相；离子源，扫描方式，喷雾针电压，筛板电压，雾化气温度及压力，干燥气温度及压力，碰撞气压力，检测电压，扫描范围。
三、样品测定
在主控界面下点击Acquisition，在进入数据收集窗口。
点击Active a Method，激活分析方法。
点击File-New Sample List，新建样品分析列表。
待System Control 界面出现Waiting 后，按Begin 键，开始自动采集数据。
四、关机及注意事项
关闭液相色谱所有模块电源；关闭氮气和氩气减压阀及钢瓶阀门
流动相2-3天更换一次；测试样品必须用流动相溶样；用
0.22μm样品过滤膜过滤。
液相色谱与质谱联用操作规程
液相色谱与质谱联用操作规程1开机步骤1.1 分别打开质谱、液相色谱和电脑电源，此时质谱内置的CPU会通过网线与电脑主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。
1.2待液相色谱通过自检，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。
a.Degasser On(打开脱气机)。
b.Wet Prime(湿灌注)。
c.Purge Injector。
d.平衡色谱柱。
1.3双击桌面上的MassLynx 4.1图标进入质谱软件。
如果进入软件时出现提示：“The embedded system is not responding, The system will run in standalone mode”，则说明质谱内置的CPU（EPC）与电脑主机的通讯联系还未建立，请稍等后再进入软件，如果打开软件仅为处理数据则没有关系（质谱主机电源未开时进入软件也会有同样提示）。
1.4点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。
1.5选择菜单“Options > Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。
等达到真空要求后，仪器前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。
1.6点击真空状态图标，检查真空规的状态，确认真空达到要求。
1.7确认氮气气源输出已经打开，输出压力为90 psi。
1.8设置源温度（Source Temp）到目标温度。
2.质谱调谐窗口各项参数设定2.1大气压化学电离源（APCI）2.2.1在质谱调谐窗口选择要使用的离子模式，Ion Mode>APCI+。
2.2.2进入Source界面，设定Source界面里各项参数。
Corona 高压放电针电流，正离子模式一般在0－10之间优化，负离子模式一般在0－5之间优化。
Source Temp 源温度，一般在120℃－150℃之间优化。
APCI Probe Temp APCI加热器温度，一般在300℃－600℃之间优化。
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主要内容
• 液相色谱-质谱联用技术简介 • 我们的仪器 • 测试准备阶段的注意事项 • 结果的解读
• 质谱基本原理
第一章 液相色谱-质谱联用技术 简介
质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比的测定来进 行分析的一种分析方法。
电离装置把样品电离为离子 质量分析器把不同质荷比的离子分开 检测器检测
清洁剂和其他表面活性剂会产生离子抑制
不能使用
表面活性剂
缓冲盐
避免使用非挥发性盐，特别是碱金属磷酸盐、硼酸盐、 柠檬酸盐等。 推荐使用甲酸铵、乙酸铵
第一章 LC-MS技术简 介
与质谱联用的液相色谱
• 流动相的流速
Column ID 4.6 mm 3.0 mm 2.1 mm 1.0 mm Capillary
Q 1 q 2 Q 2
MS 1
流量。
高流速需进行分流
需要提高毛细管温度
第一章 LC-MS技术简 介
电喷雾电离源(ESI)
第一章 LC-MS技术简 介
电喷雾电离源(ESI)
第一章 LC-MS技术简 介
大气压化学电离源(APCI)
第一章 LC-MS技术简 介
液质联用仪的离子源
• ESI
• 离子在液态产生 • 有益于热不稳定化合物的分
第一章 LC-MS技术简 介
离子源与液相色谱的流速
• ESI
• APCI
1 μ L/min - 1mL/min 最佳使用流速: 200 μ L/min 一般来说, 高流速需要高的 毛细管温度和鞘气、辅助气
200 μ L/min - 2mL/min 最佳使用流速: 500 μ L/min 一般来说，高流速需要更高 的鞘气和辅助气流量，但不
ionization，APCI）
第一章 LC-MS技术简 介
液质联用仪的离子源
正离子模式：ESI(+)或APCI(+)
适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨 或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。
负离子模式：ESI(-)或APCI(-)
适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较 多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模 式。
• APCI
• 离子在气态产生 • 不利于热不稳定化合物的分
析
• 有益于中等到高极性化合物 的分析
析
• 有益于低极性到中等极性化 合物的分析
• 有益于大分子（蛋白/多肽）
的分析
• 适合于小分子分析
第一章 LC-MS技术简 介
离子源
第一章 LC-MS技术简 介
液相色谱-质谱联用仪
真空系统
LC
离 子 源
离 子 传 输 系 统
质 量 分 析 器
检 测 器
数 据 系 统
大气
第一章 LC-MS技术简 介
质量分析器
• 质量分析器的作用
– 将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列成谱
• 主要技术参数
– 所能测定的质荷比范围
– 分辨率
• 质量分析器的种类
– 四极杆分析器（Quadrupole）
对选择离子分析具有较高的 灵敏度
– 以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分 和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片
按质量数分开，经检测器得到质谱图。
第一章 LC-MS技术简 介
液相色谱-质谱联用仪
– LC-MS, LC-ITMS, LC-TOF, LC-QqQ, LC-Q-TOF, LC-IT-
TOF, LC-Q-IT等
推荐使用水、甲醇、乙腈、异丙醇 不能使用四氢呋喃、二氯甲烷、正己烷、氯用无机酸(可能会导致腐蚀) 推荐使用醋酸和甲酸
三氟乙酸（TFA）会产生离子抑制作用
第一章 LC-MS技术简 介
与质谱联用的液相色谱
• 流动相
碱
不要使用碱金属碱(可能会导致腐蚀) 推荐使用氨水
三乙胺/三甲胺（TEA/TMA）有助于形成负离子
Flow Rate 1.0 mL/min 0.5 mL/min 0.2 mL/min 50 L/min < 10 L/min
• 样品分离的需要 • 柱子内径 • 离子源类型
第一章 LC-MS技术简 介
液相色谱-质谱联用仪
真空系统
LC
离 子 源
离 子 传 输 系 统
质 量 分 析 器
检 测 器
数 据 系 统
第一章 LC-MS技术简 介
色谱-质谱联用技术
体现了色谱和质谱优势的互补，它将色谱对复杂样品的高分离 能力与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构 信息的优点结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。
• 气相色谱-质谱联用技术(GC-MS) • 液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)
– 离子阱分析器（Ion trap）
– 扇形磁分析器 – 飞行时间分析器（TOF)
在全扫描模式下仍然具有较高灵 敏度；可实现多级质谱(MSn)的 功能
– 傅里叶离子回旋共振变换分析器
第一章 LC-MS技术简 介
单级质谱和串联质谱
单级质谱：LC-MS, LC-TOF
串联质谱
空间串联质谱：LC-QqQ, LC-Q-TOF, LC-IT-TOF, LC-Q-IT 时间串联质谱：LC-ITMS
规格：50×2.1mm、100×2.1mm、150×2.1mm、 150×4.6mm， 250×4.6mm
填料粒径：亚二微米（1.7-1.9 m）、2.5
3.5 m、 5 m
m 、3 m、
填料类型：C18、C8、-NH2、-CN等
第一章 LC-MS技术简 介
与质谱联用的液相色谱
• 流动相
溶剂
大气
第一章 LC-MS技术简 介
液质联用仪的离子源
• 离子源的作用
去溶剂 离子化 液相色谱与质谱的接口
真空过渡
去除干扰
• 大气压电离源（Atmosphere pressure ionization，API）
电喷雾电离源（Electrospray ionization，ESI） 大气压化学电离源（Atmosphere pressure chemicel
– 适用于不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定
化合物、大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多 聚物等）的分析测定
第一章 LC-MS技术简 介
液相色谱-质谱联用仪
真空系统
LC
离 子 源
离 子 传 输 系 统
质 量 分 析 器
检 测 器
数 据 系 统
大气
第一章 LC-MS技术简 介
与质谱联用的液相色谱
• 液相色谱柱