高效液相色谱质谱联用 HPLC-MS 实验 含思考题

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索
一、实验目的
1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；
2、学习LC-MS的基本操作方法；
3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。

二、实验原理
1、液质基本原理及模式介绍
液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。

但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。

LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。

现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。

质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。

（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。

实例：（Q1 = 100-259m/z）
（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。

主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。

实例：（Q1 = 259m/z）
本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：
质量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上又多了四种选择：
（三）子离子扫描模式（Product Scan）：第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。

主要用于化合物结构分析。

实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 100-259m/z）
（四）母离子扫描模式（Precursor Scan）：第一个质量分析器扫描电压选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。

主要用于同系物的分析。

实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 259m/z）
（五）中性丢失扫描模式（Neutral Loss）：第一个质量分析器扫描所有离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱。

主要用于中性碎片的分析。

实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 82-282m/z）
（六）多反应监测模式（MRM）：第一个质量分析器选择一个（或多个）特征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的SIM方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高。

主要用于定量分析。

实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 138m/z）
2、实验内容简介
邻苯二甲酸酯(简称PAEs)是一类重要的环境内分泌干扰物，常被用作塑料的增塑剂，也可用作农药载体。

近年来，随着工业生产和塑料制品的广泛使用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物体等环境样品中，成为环境中无所不在的污染物。

据报道，邻苯二甲酸酯类具有较弱的环境雌激素成分，具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。

环境内分泌干扰物是指能改变机体内分泌功能，并对机体、后代或（亚）种群产生有害效应的环境物质。

由于环境内分泌干扰物对人和动物有种种不良影
响，对环境内分泌干扰物的研究已成为国际关注的焦点。

我国也正在逐渐重视有关环境内分泌干扰物的研究。

三、仪器与试剂
1、仪器
液相系统：Varian Pro Star；
自动进样器：Varian 410自动进样器；
质谱仪：Varian 310 LC-MS/MS三重四极杆质谱仪（ESI离子源）；
色谱柱：Varian Inertsil 3 ODS-3（150mm×2mm，3μm）。

2、试剂
甲醇：HPLC色谱纯；
超纯水：Millipore Express超纯水系统制备；
标准溶液：用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液（0.1ppm）。

四、实验步骤
1、条件设置
色谱条件：流动相（90%甲醇+10%水）；流速（0.2ml/min）；扫描时间（7min）；
离子源模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；
扫描条件：Detector：1000V；Needle：5000V；Shield：600V；Spray Chamber Temperature：50℃；Nebulizing Gas Pressure：55psi；Drying Gas Pressure：18psi，Drying Gas Temperature (℃)：250℃，Capilary Voltage 30(V)，Coll.Energy 30(v)；
质量分析器：三重四极杆；
进样体积：10ul。

2、实验测定
按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。

根据表1中的数据，设置m/z，选择各种扫描模式（全扫描、选择离子扫描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式）进行测定。

3、数据处理
表1 待测物质的母离子和主要子离子
DMP DEP DBP
195.1 223.1 279.1 母离子
（m/z）
子离子
163.1 149.1 149.1 （m/z）
（一）全扫描模式方式（Scan）：
（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：
（五）多反应监测模式（MRM）：
4、思考题
1、各扫描模式中m/z分别如何设定？
（一）全扫描模式方式（Scan）：100-300m/z;
（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：279m/z;（三）子离子扫描模式（Product Scan）：Q1=279m/z,Q2=100-279m/z; （四）母离子扫描模式（Precursor Scan）：Q1=149-300m/z ,Q2=149m/z;
（五）多反应监测模式（MRM）：Q1=279m/z,Q2=149m/z;
2、比较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。

（一）全扫描模式方式（Scan）：
扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，一般用于未知化合物的定性分析。

（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。

主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。

（三）子离子扫描模式（Product Scan）：
对碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。

主要用于化合物结构分析。

（四）母离子扫描模式（Precursor Scan）：
第一个质量分析器根据某一特征离子质量扫描电压，确定该特征离子是由哪种所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。

主要用于同系物的分析。

（五）多反应监测模式（MRM）：
比其他模式更具有排他性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高。

主要用于定量分析。

3、结合HPLC等其它色谱分析技术及实验，讨论LC-MS的优势及在社会中所能起到的作用。

答：应用广泛，既能分离物质还能作精确分析，而且分析速度快，分离效率高，自动化等特点。

但表面活性剂不能进去，不能测无机离子。

可用于食品检测，药物杂质的质控等！。