真核生物基因组DNA的提取和含量测定
实验报告
课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定
指导老师： 同组学生姓名： 廖杰 成绩：__________________
真核生物基因组DNA 的提取和含量测定
【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱
的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。
一、 真核生物基因组DNA 的提取
本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。
DNP 在0.14mol/L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。
用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。
１温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性，
２可以变性Dnase ，
３还可以去除部分的蛋白。
４使核蛋白体从DNA 上解离。
然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA
苯酚:氯仿抽提法：
酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。 专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力
学号： 3100105256 日期： 2012.5.10 地点： 生化实验室 装
订 线
若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程
度上解决这个问题，促进两相的分离。
异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。
变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。
该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。
但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。
砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。
收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。
二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度
1．紫外分光光度法测定核酸含量：
由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。
2．紫外分光光度法测定DNA纯度：
由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。
若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。
三，二苯胺显色法测定DNA含量
DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595 nm处有最大吸收。
在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。
【操作与步骤】
一、基因组DNA的提取
1．组织细胞的裂解
（1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA 被降解。
（2）碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。（3）匀浆液转入2mL离心管，4℃, 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100μg/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50℃保温90分钟, 直到组织完全解体。
（4）加10mg/ml的RNase 16μl (终浓度200μg/ml)，37℃保温40min。
2．裂解物中蛋白质的去除
（1）加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 于4℃，12000rpm离心15min。离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。
（2）小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，重复上述操作以去除蛋白质，直至界面不再出现明显的变性蛋白质为止。
（3）小心吸出上面的水层并转移到另一新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。4℃，12000rpm离心15min。本步骤可去除微量的酚。
3．DNA的沉淀
(1)上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。10000rpm离心10min，弃上清。
(2)DNA沉淀溶解于3ml TE 中，进行260nm/280nm紫外检测。
二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度
1．用TE缓冲液稀释样品（5～20倍），
2．用TE缓冲液调零点，样品稀释液转入紫外分光光度计的石英比色杯中，分别测定其在260nm和280nm的吸光度。吸光度在0.2～1.2 OD范围内较为理想。
3．计算浓度：
双链DNA样品浓度(μg/μl) =A260×核酸稀释倍数×50/1000
4．计算A260/ A280比值，分析纯度。
三、二苯胺显色法测定DNA含量
1. DNA标准曲线的制定
?取10支试管，分成５组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL DNA 标准溶液。添加蒸馏水，使每管体积为2 mL。
?另取2支试管，各加2 mL蒸馏水作为对照。
?然后各加入4 mL二苯胺试剂，混匀。
?于100℃恒温水浴中保温20分钟，冷却后于595 nm处进行比色测定。
?取两管平均值，以DNA含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 制品的测定
?取2支试管，各加2 mL待测液(内含DNA应在标准曲线的可测范围之内)和4 mL二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。
3. DNA含量的计算
根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的DNA的含量。
【实验结果】
一、ＤＮＡ纯度测定结果：Ａ２８０＝２６２Ａ２６０＝３０６
Ａ２６０／Ａ２８０＝１．２
三、ＤＮＡ含量的计算：
ＤＮＡ标准曲线数据
DNA含量
0 13.3 26.6 40 53.3 66.6
（mg/L）
吸光的(λ
0 0.188 0.275 0.355 0.438 0.528
=595nm)