黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚体制备及性质研究

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黑曲霉产纤维素酶的研究进展

第8期（总第380期）2021年8月No.8 AUG文章编号：1673-887X(2021)08-0072-03黑曲霉产纤维素酶的研究进展周艳华，张春艳（长沙环境保护职业技术学院，湖南长沙410004）摘要黑曲霉是公认的安全菌株，因其无毒而受到工业界的青睐，利用黑曲霉生产纤维素酶已成为近年来的研究热点。

文章主要对黑曲霉产纤维素酶发酵方法的研究现状进行了综述。

关键词黑曲霉；纤维素酶；固体发酵法；液体发酵法中图分类号TQ925文献标志码A doi:10.3969/j.issn.1673-887X.2021.08.031Research Progress on Cellulase Produced by Aspergillus NigerZhou Yanhua,Zhang Chunyan(Changsha Environmental Protection Vocational College,Changsha410004,Hunan,China)Abstract：Aspergillus niger is a recognized safe strain.It is favored by the industry because of its non-toxicity.The use of Aspergil‐lus niger to produce cellulase has become a research focus in recent years.This article mainly reviews the research status of the fer‐mentation method of Aspergillus niger to produce cellulase.Key words：Aspergillus niger,cellulase,solid fermentation method,liquid fermentation method纤维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，其基本结构是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的纤维二糖[1]。

实验四黑曲霉原生质体的制备及再生.doc

实验四黑曲霉原生质体的制备及再生一、实验目的1、掌握黑曲霉培养的方法；2、熟悉黑曲霉原生质体的制备方法；3、懂得原生质体的再生原理。

二、实验原理获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的。

制备原生质体的脱壁酶只能采用滤菌器去菌，对于细菌和放线菌，主要采用溶菌酶；对于酵母菌和霉菌，则一般采用蜗牛酶和纤维素酶。

影响原生质体制备的因素有许多，主要有以下几个方面。

⑴菌体的预处理在使用脱壁酶处理菌体以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。

例如用EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。

EDTA能与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。

甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成，其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联，便于原生质体化。

⑵菌体的培养时间为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长期后期的菌体进行酶处理。

这时的细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。

采用这个时期的菌体制备原生质体，原生质体形成率高，再生率亦很高。

⑶酶浓度一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。

酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。

为了兼顾原生质体形成率和再生率，有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。

⑷酶解温度温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。

一般酶解温度控制在20～40℃。

⑸酶解时间充足的酶解时间是原生质体化的必要条件。

但是如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。

其原因是当酶解达到一定的时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成原生质体失活。

黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达和酶学性质研究

黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达和酶学性质研究李阳阳;刘松;尹小强;堵国成【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2022(48)6【摘要】木聚糖酶能催化木聚糖分解为低聚木糖和木单糖,对于木聚糖高效利用具有重要意义。

该研究将黑曲霉(Aspergillus niger)AG11来源的β-D-1,4内切木聚糖酶(β-D-1,4 endoxylanase,xynA)分泌表达于大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),并进行了表达条件优化和酶学性质研究。

最终确定xynA最佳表达条件为:诱导剂(异丙基硫代半乳糖苷)浓度0.1 mmol/L、诱导温度20℃、诱导起始OD_(600)值0.5。

在该条件下,胞外xynA活力达到15.8 U/mL,较初始条件提高85.9%。

重组xynA经镍柱纯化至单一条带后进行酶学性质分析。

酶学性质分析表明,重组xynA比酶活力、最适反应温度及最适反应pH分别为175.1 U/mg、50℃和4.0。

重组xynA在40℃半衰期为182 min,且在pH为2.0~9.0内孵育1 h保持在70%以上活性。

以桦木木聚糖为底物,重组xynA的K_(m)和k_(cat)分别为3.45 g/L和58.51 s^(-1)。

研究结果为xynA优良突变体的筛选和在工业生产中的应用奠定了基础。

【总页数】7页(P1-7)【作者】李阳阳;刘松;尹小强;堵国成【作者单位】粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学);江南大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.黑曲霉MAN1基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析2.黑曲霉木聚糖酶(xynZF-2)基因克隆、表达及酶学性质分析3.耐热耐碱木聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达及酶学性质研究4.黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究5.黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶A基因在大肠杆菌中的表达及产物酶学性质研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

【word】黑曲霉产纤维毒酶系各组分特性及酶解条件

黑曲霉产纤维毒酶系各组分特性及酶解条件第22卷第1期200t年1月华侨大学(自然科学版)Journal0FHuaqiaoUniversity(Natural,Science)V0L22No.1Jan.200t文章编号1000—5013(2001)Ol一065—05黑曲霉产纤维素酶系各组分特性及酶解条件戴四发贺淹才(华侨大学材料科学与工程学院.泉州3620l1)摘要采用正交实验法分析出黑曲霉3,316纤维索酶系各组分最适酶解条件,其组台分别为C1酶(pH5.O,45℃)C酶(pH35.65_c)和卢G酶(pH4.5,65℃).在液体发酵条件下,添加质量分数为o.003的碳酸钙时.各组分酶活性最高.其中以C酶明显增高.c】酶几乎无影响.G酶则明显降低.c和C比酶栝只有在碳酸钙质量分数小于n005时才有提高.G酶别明显降低.暴加蛋白胨.C和卢G酶的最高酶活在碳酸钙质量分数小于0.003时有增加,C酶则无明显变化.碳酸钙和蛋白胨对各组分最高酶活形成时间均无影响.在各组分酶分泌规律方面,仅有碳酸钙对C和口G酶有一定影响美毽词黑曲霉.纤维紊酶系,酶组分.液体发酵.酶解条件中围分类号Q55603文献标识码A真菌纤维索酶系(CellulaseSystem)是一类复杂的复台酶,一般包括3种水解酶.(1)内切葡聚糖酶(end0g1ucanase).1,4(1,3,1.4)一卢一D—glucan4glucanohydrolase,EC3.2.L4,简称C1酶或EG.(2)外切葡聚糖酶(exoglucanase).1,4-8一D—glucanceIl0bi0hydr0lase,EC3.2.1.9l,简称C酶,亦称外切纤维二糖水解酶(CBH).(3)葡萄糖苷酶(p—glucosidase).p-D—glu—cosideglucohydrolase,EC3.2.1.2l,简称卢G,亦称纤维二糖酶.C1酶和C 酶存有多种异构酶,只有各组分酶的共同协同作用,才能将纤维索彻底水解为葡萄糖..在黑曲霉(As—pergiUusNiger)产纤维索酶变化规律特性方面,一般是通过固体发酵从单一组分酶考虑分析的.一.本文就在液体发酵条件下,对添加一些物质对酶系不同组分的影响效应,以及产酶变化特性方面进行了研究.1材料与方法1.1菌种及来源黑曲霉3.316,中国科学院微生物研究所菌种组提供1.2培养基与菌种保藏收稿日期2000—06—19作者简介戴四发(1973一),男.讲师基金项目福建省自然科学基金资助项目华侨大学(自然科学版)2001年(1)斜面培养基.即土豆汁葡萄糖琼脂培养基.将孢子接种于斜面培养基,于28℃下培养,待形成一层绿色孢子后(约7d),于4℃保藏备用.(2)基础培养基.加浓的Mandles盐,添加质量分数为0.01的纤维索粉和质量分数为0.02的麦麸.(3)产酶培养基.在基础培养基中添加不同浓度的营养物质.1.3孢子悬液与酶液制备(1)孢子悬液制备.从新长成的斜面洗下孢子,以磁力搅拌器搅拌约20min打散孢子后,用显微镜记数,并调节为每毫升孢子(1.00_--4-0.05)×10个.(2)酶液制备.将孢子悬液以体积分数为0.01的接种量接人装有50mI,产酶培养基的250mL摇瓶中,转速为190r?min,28℃发酵培养.取适量发酵液,于转速4000r?minI1下离心15min,用0.1mol?LI1磷酸氢二钠一0.1mol?LI1柠檬酸缓冲液适当稀释上清液即为酶液.1.4定糖分析采用DNS法”进行定糖分析,以葡萄糖为标准,以相同稀释倍数的酶液作为空白对照.1.5蛋白质测定采用Bradford法进行蛋白质质量分数的测定,以牛血清白蛋白为标准.1.6酶活测定和比酶活()的计算(1)C酶活测定.取1.0mL一定pH值的酶液,加入(25.0=1:0.5)mg脱脂棉于试管中密封,在45℃下酶解20h后定糖.酶活力单位U(u?mLI1)为每小时由底物产生还原糖(以葡萄糖计)的微摩尔数.(2)C酶活测定.取酶液0.25mL,加入0.25mIpH值相同的质量分数为0.005的羧甲基纤维素钠溶液,于65℃酶解30min后定糖,酶活力单位同c的酶活力单位.(3)BG酶活测定.酶解底物为质量分数0.005的水杨素溶液,酶解方法与c酶活测定相同,酶活力单位同c-的酶活力单位.(4)比酶活u.(u-mg)的计算.Uo=u/w,式中为蛋白质质量分数.2结果与分析2.1黑曲霉纤维素酶系各组分最适作用条件分析以基础培养基发酵制得的酶液作为实验材料,通过两因素(pH值和温度口)五水平正交实验进行分析.酶活结果(本文仅列出3组具有高酶活的条件组合),如表1所示.Cl酶最适作用表1黑曲霉3.316纤维煮酶系各组分最适酶解条件组合分析条件组合为pH5.0和45℃及pH5.5和45℃.其最适pH值范围为4.5～5.5,最适温度范围为45~55℃.C酶最适作用条件组合为pH3.5和65℃及pH3.0和65℃,最适pH值范围为4.0～4.5,最适温度范围为60b65℃.第1期戴四发等:黑曲霉产纤维索酶系各组分特性及酶解条件672.2碳酸钙对黑曲霉产纤维素酶系特性的影响碳酸钙质量分数()对酶系各组分最高酶活,比酶活及其形成时间(f)的影响,如表2所示.表2中各组分最高酶活形成时间不变.当质量分数为0.003时,各组分最高酶活均最高,其对C酶明显,对C酶无影响,而对于G酶则明显降低.各组分酶活均随质量分数增高而大幅度降低,c.和c比酶活只有在质量分数低于0.005时才有提高,G酶均降低明显表2碳酸钙对黑曲霉产纤维索酶系各组分最高酶活及其形成时间和比酶活的影响碳酸钙对酶系各组分酶活变化规律的影响,如图l所示.将图l与图2比较表明,质量分蓄图1碳酸钙对黑曲霉产纤维煮酶系图2纤维素粉和麦麸对黑曲霉产钎维素酶系各组分变化规律的影响各组分变化规律的影响数为0.005的碳酸钙使c酶活第二峰值大幅度地高于第一峰值.它缩短了卢G酶的峰值急剧增长期,并较为稳定,而对c影响不大.2.3蛋白胨对黑曲霉产纤维素酶系特性的影响表3为蛋白胨质量分数()对纤维素酶系各组分最高酶活,比酶活及其形成时间的影响.由表3可知,各组分酶最高酶活形成时间均未改变.c-和G酶的最高酶活基本上随质量表3蛋白胨对黑曲霉产纤维素酶系各组分最高酶活及其形成时间和比酶活的影响68华侨大学(自然科学版)2ooi年分数的增加而降低,且均在质量分数小于0.003时有促进作用,C酶则无明显变化.各组分比酶活都有所降低,且随质量分数增加而降低更明显.蛋白胨对酶系各组分酶活变化规律的影响,如图3所示(以蛋白胨质量分数0.002为例).图3与图1比较可知,蛋白胨对纤维素酶各图3蛋白胨对黑曲霉产纤维素酶系各组分变化规律的影响组分酶的分泌变化规律均无明显影响,仅有酶活值上的改变.3讨论有关真菌产纤维素酶系特性等方面,人们主要是以绿色木霉为研究对象,而极少有黑曲霉方面的报道(Jl一般都限定在固体发酵条件下.).因此,这样很不利于现代化大规模的流水线生产.不同培养时期,黑曲霉纤维素酶系各组分酶问的均衡性很不一致,为一个动态变化的复合酶体系.同一培养基形成的不同组分酶的分泌规律间有较大的差别,且形成高峰值的时问常常不一致.这可能与纤维素在不同分解时期所形成的各种产物及其质量分数,对不同酶组分所起的不同反馈作用(诱导或阻遏)有关.不同物质对纤维素酶系各组分的影响不一.同种物质不同质量分数,同样有不同的影响效果,即使同种质量分数的同样物质,其对酶系不同组分的影响也会有较大区别.一些物质具有促进某一组分酶的大量分泌,但却抑制其它组分的性质.因此,可以通过培养基的改变,有目的地提高单一组分酶(特别是G酶的产量较高,与绿色木霉酶系形成互补)的产量.从比酶活看,虽然某些物质可以提高酶活值和酶产量(以可溶性蛋白为准,本文未列出),但其比酶活却明显下降.即此种酶的纯度更差,这不利于发酵工程的下游提纯过程.从各组分酶分泌规律分析看,使用不同的影响物质,c酶具有最大的稳定性,其次为c酶,pG酶则相对容易变化.其根本原因,还须进行研究.第1期戴四发等:黑曲霉产纤维素酶系各组分特性及酶解条件69参考文献1StenbergK,GalbeM,ZacchiG.TheinfluenceoflacticacidformationOnthesti muhane0ussaccharifa—cationandfermantationofsoftwoodtoethanol—usingsaecharomycescerevisi aeandbeta—glucosidaseandcellulase—mediatedhydrolysis[J].EnzymeMicrob.Techno1.,1990,26(1):7 1～792GilliganW,ReeseET.Evidenceformultiplecomponentsinmicrobialcellulas eⅡ].Can.J.Microbia1.,1954.1:90～1073赵小立t周红军,费承伟等.黑曲霉HD9478纤维素酶固体发酵条件的研究[J]粮食与饲料工业,1997,5:21～234亲晓斌,李骁华,丁建琴.黑曲霉产纤维素酶舶研究rJ].生物技术,1997,7(4):13~155曲音波,高墙基,王祖农-青霉的纤维素酶抗降解物阻遏突变株的选育[阳.真菌,1984,3(4):2382438中山大学生物系微生物学教研ona]test,theoptimelenzymolylsconditionforrespectivecomponentofcellase systemfromAspergillus|Ⅳr3.316inducedliquidfermentationarefoundtohepH5.0,45℃forenzymeCl,andpH35,65℃forenzymeCandpH4.5,65℃forenzyme.Undertheconditionofliquidstarefermentation,theadditionofCaCO3inaconcentrationof0.3leadstothehighest enzymeactivityofvariORScomponents.InwhichthatofC-obviouslyincreases,thatofCisalmostunaf fected,whilethatof船obviouslydecreases.TheenzymeactivityratioofCLandCincreasesonlyifCaC Okeepsinaconcentrationbelow0.5,whileCshowsnosignificantchange.Theadditionofpeptoneleadstot hehighestemymeactivityofCtandofCaCO3keepsnaconcentrationbelow0.3whileitleadstoinsign ibicantchangeofC. TheformationtimeofhighestenzymeactivityOfrespectiveIomponentareunef fectedbyCaCO3andpeptone. RegardingtotheruleofenzymesecretionofrespectivecomponenttonlyCaCOl showsacerta[neffectonC1and∞.KeywordsAspergillusNigertcellutasesystem,enzymecomponent,liquidfer mentation,enzymolysiscon.d{tinn。

黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶的纯化及性质分析

黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶的纯化及性质分析陈巍;詹佳;余川;魏炜【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2012(42)1【摘要】Lipase from Aspergillus niger was purified approximately 10-fold with 50 % final yield using ammonium sul-fate graded precipitation, hydrophobic interaction chromatography (phenyl-sepharose), anion-exchange chromatography chromatography (DEAE-Sepharose 4B). Molecular weight was approximately 35 kD. Optimum pH and temperature were 37 "C and 9.5 respectively. Lipase was stable within the pH range 6.0-11.0 and temperature below 50 *C , belonging to alkaline lipase. Metal ions Mg2* ,Ca2+ ,Cu2+ ,Zn2+ ,Co2+ ,Mn+ stimulated its activity, whereas Al3+ , Fe2+ , Fe3+ caused inhibition. Denaturant SDS was a strong inhibitor while urea and guanidine hydrochloride had no much affect. Aminophenol modifier NBS and PMSF inhibited lipase activity intensively, NBSF and DTT had no effect at low concentration while 2,3-butanedione affected it at high concentration. Half-life of lipase was enhanced by stabilizer NaCl, PEG, glycerol, sorbitol and sodium alginate. Lipase was resistant to trypsin under certain conditions.%从黑曲霉发酵液中经硫酸铵分级沉淀,Phenyl-Sepharose疏水柱层析,DEAE-Sepharose 4B阴离子交换柱得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数达10倍,回收率50％.对脂肪酶的性质分析表明:该酶分子质量约为35 kDa,最适温度和最适pH分别为37℃和9.5,50℃以下和pH6.0～11.0之间保持稳定,属于碱性脂肪酶.Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+对该酶有激活作用,而Al3+、Fe2+、Fe3+对酶有严重抑制作用.变性剂盐酸胍和脲对其未见显著影响,而SDS强烈抑制其酶活.用不同氨基酸修饰剂对酶进行修饰,其中NBS和PMSF强烈抑制该酶活性,NBSF和DTT在低浓度下对酶活影响不大,2,3-丁二酮在高浓度下影响其活性.外加稳定剂如NaCl、PEG、甘油、山梨醇、海藻酸钠,均可不同程度的延长脂肪酶的半衰期.在一定质量比条件下,该酶有良好的抗蛋白酶性质.【总页数】6页(P68-73)【作者】陈巍;詹佳;余川;魏炜【作者单位】四川大学生命科学学院,四川成都610064;四川大学生命科学学院,四川成都610064;四川大学生命科学学院,四川成都610064;四川大学生命科学学院,四川成都610064【正文语种】中文【相关文献】1.黑曲霉Aspergillus niger S菌株所产β-葡糖苷酶的纯化和酶学性质 [J], 王云;曾沃坦2.黑曲霉(Aspergillus niger)三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPD)的序列测定与同源性分析 [J], 赵莲;苟兴华;张义正3.黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 舒正玉;杨江科;闫云君4.黑曲霉（Aspergillus niger）纤维素酶系中内切β—葡聚糖酶性质的研究 [J], 王沁;赵学慧5.黑曲霉Aspergillus niger SL2-111所产酸性蛋白酶的分离纯化及酶学特性 [J], 谢必峰;曹治云;郑腾;王水顺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑曲霉原生质体诱变及其产纤维素酶条件研究

纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资源和能源，如果能利用纤维素酶将天然纤维素降解为可利用的低聚糖，再进一步转化为生物乙醇等物质，对解决当前世界所面临的能源危机和环境污染问题具有深远的意义【”。据报道，产生纤维素酶的微生物大多是木霉属菌株，而利用黑曲霉生产纤维素酶的报道较少【２】。本文选择黑曲霉作为出发菌株，通过紫外线、硫酸二乙酯对其原生质体进行复合诱变育种，并对其产酶条件进行了优化，以期进一步提高其纤维素酶活力，弥补木霉属菌株的不足。
原生质体再生培养基，３０℃培养３ｄ，计算再生率。原生质体再生率＝（再生菌落数／原生质体数）ｘ１００％
１．２－３原生质体诱变处理
项目１广可广嚆≯≮孑１而表１紫外照射时间对原生质体致死率的影响
．；。
照射时间（ｓ）
１．２．３．１紫外线诱变（ＬｒＶ）将适量原生质体悬液置于无菌培养皿中，置于１５Ｗ
紫外灯下，距离１０ｃｍ照射不同时间，红灯保护下吸取原生质体悬液１ｎ也，涂布于再生培养基平板上。取未经紫外线处理的原生质体悬液１ｍＬ，同样涂布于平板做对照，置于培养箱中３０℃恒温培养３ｄ计数，计算致死率。１．２．３．２硫酸二乙酯（ＤＥＳ）诱变
ｌ材料与方法
１．１材料黑曲霉３０７８６，购自中国农业微生物菌种保藏中
心；生物传感器（ＳＢＡ一４０型），购自山东省科学院；渗透压稳定剂：０．８ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液；硫酸二乙酯（ＤＥＳ）溶液：２ｍＬＤＥＳ溶于８ｍＬ９５％ｖｏｌ乙醇，备用。
无菌复合酶液：将一定量的纤维素酶、蜗牛酶及溶菌酶溶于渗透压稳定剂，充分振荡溶解后，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，用０．２２Ｉｘｍ滤膜过滤除菌；配制成０．５％纤维素酶＋０．５％蜗牛酶＋１．０％溶菌酶的混合酶液。

无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达

无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达黑曲霉作为一种重要的工业生产菌株,已逐步开发成为一种重要的酶表达系统。

在本研究中,首先选择一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株为表达宿主,并对农杆菌介导转化法和PEG-原生质体转化法进行条件优化,然后以脂肪酶为模式酶在黑曲霉中进行同源/异源脂肪酶的表达。

通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表达量,并进行了酶学性质研究。

最后初步开展了CRISPR/cas9技术在黑曲霉表达系统中的应用,构建了尿嘧啶缺陷型菌株。

主要结果如下:（1）对农杆菌介导转化和PEG-原生质体转化两种方法进行了条件优化。

优化后农杆菌介导转化的条件是不萌发的新鲜孢子与OD600培养至0.9-1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol·L-1的IM平板上,23 oC避光培养48 h后进行转膜。

最佳转化效率大约为每106个孢子获得60±5个转化子,并且阳性率保持在90%以上。

原生质体制备条件为:107个?mL-1黑曲霉孢子接种PDA浸提液,30 oC,200 r·min-1培养24 h,收集菌丝体,按质量体积比1:10加入裂解酶液(0.8 mol·L-1 MgSO4,1%纤维素酶,0.5%蜗牛酶,0.25%溶菌酶),37oC,120 r·min-1酶解2.5 h后收集原生质体,获得原生质体个数约6.8×105个?mL-1,原生质体再生率约63±2.5%。

复合诱变选育高产脂肪酶黑曲霉菌株及其固定化酶性质

天然产物研究与开发N at Prod Res Dev 2010,22:2092214,231文章编号:100126880(2010)022*******收稿日期:2009204223 接受日期:2009209224基金项目:湘潭市科技重点资助项目ZD20081027;教育部/大学生创新实验计划0项目081053013*通讯作者Te:l 862731258298175;E 2m ai:l hyzeng @xtu 复合诱变选育高产脂肪酶黑曲霉菌株及其固定化酶性质孟娟,曾虹燕*,张艳梅,夏葵,刘贵湘潭大学化工学院生物技术研究所,湘潭411105摘要:通过硫酸二乙酯(DES)和微波复合诱变,获得遗传性状稳定的高产脂肪酶黑曲霉突变菌株C M 2,酶活达174.93U /mL 。

对菌株C M 2培养条件的优化,以橄榄油和(N H 4)2S O 4为最佳碳、氮源,在28e 、p H 7.5的条件下,发酵CM2菌株68h ,脂肪酶活为180.52U /mL 。

大孔树脂固定化脂肪酶在35~55e 和p H 7.5~9.5之间有很好的稳定性。

游离酶和固定化酶的表观失活活化能分别为52.6842kJ/m ol 和30.8391kJ /mo,l 固定化酶对温度的敏感度降低,耐受性增强。

在微水相中脂肪酶催化22辛醇和乙酸乙烯酯不对称酯交换反应中,(S )2乙酸辛酯的对映选择性高(游离酶e .e .S85.7%;固定化酶e .e .S87.7%),显示了该固定化酶在22辛醇的手性拆分方面具有良好的应用前景。

关键词:黑曲霉;脂肪酶;复合诱变;固定化;酶拆分中图分类号:Q814.2;Q939;TQ645文献标识码:AC o m positeM u ta ti on Breed i ng of As pergill u s n i ger Stra i n w ithH i gh L i pase A cti vity and I mm ob ilized L i pase P roper tiesMENG Juan,Z ENG H ong 2yan *,Z HANG Yan 2me,i X I A Ku,i LI U GuiB iotechnolo gy R es ea rch Institute ,College of Che m ica l Eng i neering,Xiang tan Un i versit y ,Xiang t a n 411105,Ch i na Abstr a ct :The As perg illus ni g erC M 2w it h h i gh li pase acti vity (174.93U /mL)was o bta i ned by co m bini ngm icro wave ir 2rad i atio n with DES .The hered i ta ry character of t he strai n C M 2was stab le .The culture cond iti ons of the stra i n C M 2were opti m ized .The li pase acti vity was 180.52U /mL when t he stra i n was cu ltured i n the m ed i u m at 28e and p H 7.5for 68h ,whe re olive oil and (N H 4)2SO 4we re used as the carbo n and n itro gen so urces ,respecti ve l y .Co mpar i ng with the free li pase ,the i m mob ili zed lipase adsorbed on the m acroporous resi n possessed hig her stab ilit y at 35~55eand p H 7.5~9.5.The apparen t i nacti vatio n energy of free and i m m o b ili zed li pase was 52.6842and 30.8391kJ/m o,l respectively .The result sho wed that i m m o b ilized lipase was m ore tolerant and i nsensiti ve to te m pe rature .The transester ifi catio n of (R,S )222oc tanol w ith vi nyl ace tate asyrn m e tricall y cata l yzed by the free and i m m obilized li pases i n m icroaqueous phase .The enantiose l ectivit y of (S )2oc t yl aceta te was h i gh ,and e .e .S85.7%for the free lipase and e .e .S87.7%f orthe i m m o b ilized li pase .The results sho wed tha t t he li pase fro m As pergillus ni ger strain had a goo d appli catio n potential inthe enzy m a tic resol utio n of (R,S )222oc tano 1.K ey word s :As perg illus ni ger ;li pase ;m utati on ;i m mob iliza ti on ;resol utio n of 22octanol脂肪酶(EC 3.1.1.3)作为一类非水相生物催化剂在有机合成中具有重要的应用价值。

内生黑曲霉产脂肪酶条件研究及其粗酶酶学特性

内生黑曲霉产脂肪酶条件研究及其粗酶酶学特性何茹;刘娅;谢晓霞;王陈强【摘要】针对新疆酿酒葡萄中获得的1株产脂肪酶的内生黑曲霉菌株C2J6,研究了该菌株的产酶条件及酶学特性.结果表明,该菌适宜的产酶条件为1％的乳糖为碳源,1％的蛋白胨为氮源,培养基初始pH值为8.0,培养温度35℃,培养时间约72h,此时所产脂肪酶的活力可达18.75U/mL.该菌所产脂肪酶粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为7.0,为中温中性酶;在50℃保温1h酶活力保留54.55％,具有良好的热稳定性;在pH值3.0～7.0范围内较稳定,有一定的耐酸性.金属离子Mn2+对酶活力有促进作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg对酶活力影响不大.该酶在以葵花油和谷物调和油为底物时,酶活分别为228％和180％,明显高于橄榄油和油烟机废油.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2014(033)003【总页数】5页(P52-56)【关键词】内生黑曲霉;脂肪酶;产酶条件;酶学特性【作者】何茹;刘娅;谢晓霞;王陈强【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心,新疆库尔勒841000;新疆冠农果茸集团股份有限公司技术中心,新疆库尔勒841000【正文语种】中文【中图分类】TQ925脂肪酶（EC3.1.1.3）又称三酰基甘油酰基水解酶，可将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或进行其逆反应，在油-水界面及非水介质中催化酯的水解和合成，酯交换，催化生物表面活性剂、高聚合物、多肽和手性药物的有机合成反应等[1]。

目前，脂肪酶已广泛应用于食品、香料、医药、化妆品、洗涤剂、皮革、药物合成、有机合成等领域[2-4]。

微生物脂肪酶因其具有较动植物脂肪酶更好的稳定性、选择性、底物特异性、更广的作用pH值和温度范围，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，便于工业化大生产和获得高纯度样品，因此成为工业脂肪酶的最重要来源。

磁性金属—生物分子框架材料固定化黑曲霉脂肪酶及其应用研究

磁性金属—生物分子框架材料固定化黑曲霉脂肪酶及其应用研究对映体纯环氧化物是一类具有高附加值的有机合成中间体,在医药、农药、精细化工及食品等领域有着广泛的应用,以其作为原料能够合成许多具有价值的化合物,如光学活性材料、手性药物及杀虫剂等。

在对映体纯环氧化物的合成方法中,脂肪酶催化烯烃环氧化生成环氧化物是一个新兴的研究热点,它具有高效、经济、绿色、反应条件温和、对映体选择性高等优点。

本研究发现黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger lipase,ANL）能够有效地催化环辛烯环氧化,但是在环氧化反应过程中游离脂肪酶失活现象严重且难以重复回收利用,这些缺点造成其工业生产成本较高因此难以大规模生产。

为解决以上问题,提高酶的稳定性,降低其催化成本,本研究利用一种生物相容金属有机骨架材料（ZnGlu）和四氧化三铁纳米粒子（MNPs）构建而成的磁性金属-生物分子框架纳米材料（ZnGlu-MNPs）为载体对黑曲霉脂肪酶进行固定化并将其应用于催化环辛烯环氧化。

本研究首次研究了磁性金属-生物分子框架纳米材料固定化黑曲霉脂肪酶,并将其酶制剂应用于高效催化环辛烯环氧化反应。

本研究通过理性设计制备成一种活性高、稳定性优良、载酶量高、分离回收方便的新型纳米级酶制剂ANL@ZnGlu-MNPs。

该研究有助于丰富酶的固定化技术,深化对酶-载体相互作用的认识,为制备对映体纯环氧环辛烷提供了一个新途径。

本研究首先采用改进的碱共沉淀法合成了MNPs,然后利用层层静电自组装技术将ZnGlu包裹在MNPs表面,制备得到磁性金属-生物分子框架纳米材料ZnGlu-MNPs,通过扫描电镜、红外光谱、X射线衍射、热重分析和磁饱和强度等对ZnGlu-MNPs进行结构表征和成分分析,结果表明成功制备得到ZnGlu-MNPs,并且其具有较强的磁性。

其次,以制备的ZnGlu-MNPs作为载体,利用载体表面ZnGlu中含有的氨基与含有游离羧基的ANL分子发生酰化反应,从而将ANL固定在ZnGlu-MNPs表面,制备得到一种活性高、稳定性高、易分离回收的新型磁性纳米级酶制剂ANL@ZnGlu-MNPs。

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黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚体制备及性质研究
脂肪酶是一种极具商业价值的丝氨酸水解酶类,可用于食品、医药、化工等行业。

但大多数天然脂肪酶都存在稳定性差、易变性失活以及不可回收利用等缺点,这导致脂肪酶的应用受到限制。

因此,本研究采用来自于黑曲霉GZUF36的胞外脂肪酶(extracellular lipase from Aspergillus niger GZUF36,ANL)进行交联酶聚集体(Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)制备,以获得酶活力高、稳定性强且可多次回收利用的固定化脂肪酶。

此外,通过对黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交联酶聚集体(CLEAs-ANL)酶学性质、二级结构、形态外貌以及选择性进行研究,为后续该酶在功能性油脂的合成以及工业化大规模应用提供参考依据和理论基础。

主要内容和结果如下:(1)当叔丁醇与粗酶液体积为4:1,交联剂添加量为30μl,交联时间为1.5小时,离心转数为6000 r/min时为制备CLEAs-ANL的最佳条件。

在该条件下,CLEAs-ANL酶活回收率为100.3±1.1%,酶活力可达13.8±0.51 u/ml。

研究了不同添加剂如BSA、BSA水解产物、油酸、庚烷、Tween-80、以及SDS 等对CLEAs-ANL活性的影响,结果显示BSA、BSA水解液,Tween-80都可对CLEAs-ANL活性起到改善作用,CLEAs-ANL酶活回收率分别可提高11.3%、6.5%、4%。

而油酸、SDS和正庚烷对CLEAs-ANL活力会产生负面影响,不适合用作CLEAs-ANL制备的添加剂。

(2)通过丙酮沉淀与反胶束萃可对黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶进行部分纯化。

电泳结果显示介于31~43之间出现的条带为目标条带。

将部分纯化的脂肪酶用于制备CLEAs并研究其酶学性质。

结果显示
CLEAs-ANL的最适温度为40℃,较游离酶增加了5℃。

在最适反应pH方面,游离酶最适反应pH为6.5,而CLEAs-ANL在pH 4.0-6.0差异不显著。

说明该脂肪酶固定化后表现出较好的耐酸性。

CLEAs-ANL不仅在温度稳定性和pH稳定性方面显示出比游离酶更高的稳定性。

而且在不同有机溶剂中的耐受性也普遍高于游离酶。

在储藏稳定性方面,游离酶和CLEAs-ANL在储藏30天后相对酶活分别为
26.3±1.6%和82.5±4.1%。

证明该脂肪酶经交联后储藏稳定性得到改善。

在操作稳定性方面,CLEAs-ANL在经过8次回收利用以后仍保持34.9%的相对酶活,操作稳定性良好。

最后,通过对游离酶和CLEAs-ANL的动力学参数测定,游离酶的Vmax和Km分别15.9和44.35,而CLEAs-ANL的Vmax和Km分别11.95和226,表明该脂肪酶经固定化后底物亲和性和最大反应速度降低。

(3)通过FTIR检测结果显示,CLEAs-ANL的β-折叠和β-转角相对于游离酶
分别增加了31.54%和2.88%,而α-螺旋和无规则卷曲分别减少了5.05%和29.32%。

这说明该脂肪酶经交联后刚性增强而柔性降低。

SEM结果显示CLEAs-ANL表面结构相对于游离酶更紧凑和均匀。

且在15;000X 放大倍率下可观察到表面有簇状和空穴,表明底物分子与酶催化位点更容易接触,这利于反应的进行。

CLEAs-ANL的粒径约在50μm左右。

该粒径符合一般CLEAs的粒径范围。

最后通过TLC和HPLC进行选择性分析可知,游离酶和CLEAs-ANL在水解反应中都显示sn-1,3位置选择性。

说明交联过程不会对CLEAs-ANL在水解反应中的位置选择性产生影响,而通过与ppl的产物对比,游离酶和CLEAs-ANL在水解反应中显示出的sn-1,3位置选择性高于ppl。

然而,在甘油解反应中未检测到游离酶甘油解的反应产物,而CLEAs-ANL的甘油解反应产物中不仅有1,3-DAG的生成,还有部分1,2-DAG的存在,说明CLEAs-ANL在甘油解反应中的选择性有所改变,这可能是因为有机溶剂对CLEAs-ANL的选择性产生了影响。