海藻酸钠固定化脂肪酶的制备及性质研究
固定化酶制备及酶活力测定
实验三固定化酶制备及酶活力测定【实验目的】1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。
2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。
在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。
固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。
酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法等。
载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上(图1)。
一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。
最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。
①共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。
在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。
海藻酸钠功能特性应用研究进展
河南科技2011.9上海藻酸钠又称藻酸钠、海草酸钠、褐藻胶,分子式为(C6H7O6Nan,是一种从褐藻类的海带或马尾藻中提取的聚阴离子多糖(海藻酸的钠盐。
自1883年由海带中发现AGS,直至1929年开始在美国应用于工业生产,1944年用于食品工业,1983 年经美国食品与药品管理局(FDA批准直接作为食品的成分用于医药工业不过近30年的时间。
海藻酸钠具有增稠性好、成膜性好、凝胶强度高、成丝性好等优点,是良好的食品添加剂。
当今,在美国,海藻酸钠被誉为奇妙的食品添加剂;在日本,被誉为长寿食品;在英国、挪威和东南亚等国,已广泛用于食品工业。
目前,国际海藻酸钠贸易量约为2.2万t,其中美国和挪威的公司销量占71%。
国际海藻酸钠的总需求将稳中有升,因此,我国海藻酸钠生产也必须加大幅度,而且还应把工作重点放在提高质量、增加品种上。
如今非降解的塑料制品已被广泛应用于许多领域,但是它所带来的环境污染日益威胁人类的生存。
因此,对可降解的“环境友好”材料的研究与开发日益受到人们的重视。
海藻酸钠以其良好的生物降解性和生物相容性,被广泛应用于化学、生物、医药、食品等领域。
本文,笔者探讨了海藻酸钠的结构特性,并介绍其应用研究进展。
一、海藻酸钠的结构及分子量海藻酸钠单位分子量:理论值198.11,平均真实值222.00,大分子32000~250000,是由1,4-聚-β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid,简称M和α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid,简称G组成的一种直链多糖,整个分子由3种片段即聚甘露糖醛酸片段(Poly-mannuronate,PM,或MM、聚古罗糖醛酸片段(Poly-guluronate,PG或GG和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸杂合段(MG block通过1,4-糖苷键链接而成线性嵌段共聚物。
化学结构式见图1。
PM和PG链式结构相似,单糖组分区别仅在C5上羟基位置不同。
海藻酸钠的研究与应用进展
海藻酸钠的研究与应用进展【摘要】本文主要围绕海藻酸钠的研究与应用进展展开讨论。
首先介绍了海藻酸钠的物理化学性质研究，包括其结构特点和药理学作用。
然后探讨了海藻酸钠在医药领域中的应用，如药物缓释和药物递送系统。
接着分析了海藻酸钠在食品工业中的广泛应用，如增稠剂和抗氧化剂。
还阐述了海藻酸钠在化妆品领域中的功效，如保湿和抗皱。
最后探讨了海藻酸钠在环境保护中的作用，如废水处理和土壤修复。
通过对这些应用领域的探讨，展望了海藻酸钠在未来的广阔应用前景，并总结了其研究与应用进展，为进一步推动海藻酸钠在各个领域的发展提供了参考依据。
【关键词】海藻酸钠、研究、应用、物理化学性质、医药、食品工业、化妆品、环境保护、前景展望、总结1. 引言1.1 海藻酸钠的研究与应用进展海藻酸钠是一种常见的天然多糖，在近年来得到了广泛的研究和应用。
海藻酸钠具有许多优良的物理化学性质，如可溶性、黏度稳定性和生物相容性等，这使得它在医药、食品、化妆品和环境保护等领域都有着重要的应用价值。
其在医药领域中被广泛应用于制备药物缓释剂和辅助剂，如口服药物包衣、注射剂和眼药水等。
在食品工业中，海藻酸钠常用作增稠剂、稳定剂和凝胶剂，广泛用于冰淇淋、果冻、奶酪等食品的加工中。
而在化妆品领域，海藻酸钠常用作保湿剂和抗菌剂，能够提高化妆品的稳定性和质感。
在环境保护方面，海藻酸钠被广泛应用于废水处理和土壤修复，能够有效吸附重金属离子和有机物质，起到净化环境的作用。
随着人们对天然产物的需求不断增加，海藻酸钠的研究与应用前景将更加广阔。
通过持续不断地深入研究和创新应用，海藻酸钠必将为人类社会的可持续发展做出更大的贡献。
2. 正文2.1 海藻酸钠的物理化学性质研究海藻酸钠是一种来源于海藻的天然产物，具有许多重要的物理化学性质。
海藻酸钠是一种无色至微黄色的结晶性粉末，易溶于水，但不溶于有机溶剂。
其水溶液呈中性或微碱性，具有良好的稳定性和透明度。
海藻酸钠具有较高的凝胶能力，在适当的条件下可以形成坚固的凝胶体系。
海藻酸钠固定化预实验
植物细胞固定化预实验实验目的：熟悉海藻酸钠做固定剂下植物细胞固定化培养试验操作。
实验材料：悬浮培养的植物细胞种子、250ml三角瓶5个、培养皿、移液枪、电子称、电磁搅拌器、滴管或注射器、烧杯、纱布、漏斗、铁架台。
实验步骤1.实验准备：配制植物细胞液体培养基分装到4个250ml三角瓶中，每瓶70ml；溶液；配制40g/L的海藻酸钠溶液100ml并称量配制好配制一定量20g/LCaCl2。
的海藻酸钠溶液质量w12.灭菌3.制备凝胶球3.1取种子液用两层无菌纱布过滤，收集滤液。
3.2静置滤液，用移液枪移去上层培养液至于事先准备好的无菌三角瓶中备用。
获得植物细胞。
3.3取鲜重20g的细胞于配置好的无菌还在酸钠溶液中边加入边用电磁搅拌器搅拌。
溶液中形成直径3.4用滴管或注射器吸取海藻酸钠--细胞混合液滴入无菌CaCl2溶液，用无菌水充分洗涤凝胶珠。
3--5mm的凝胶球，放置30--60min后倒出CaCl2）/20g加入到含70ml新鲜培养基+10ml原培养基3.5称量胶球质量w=8*（20+w1的三角瓶中，制作两瓶。
称量植物细胞鲜重8g加入到含70ml新鲜培养基+10ml 原培养基中做对照。
4.在一定条件下进行摇瓶振荡培养，每5天取发酵液测定培养基组分消耗情况、代谢产物的生成速率等并观察记录胶球完整情况。
植物细胞固定化培养原理及海藻酸钠浓度单因素试验方案科学研究发现，密集而有一定程度分化的、生长缓慢的细胞培养物，较分散而无结构的、生长迅速的细胞培养物累积更多的次生代谢物。
其原因为:前者细胞所处的理化环境与其在整体植物中所处的环境类似，细胞因而能够发挥正常的代谢功能；而对后者而言，细胞在培养液中所处的环境既无极性，也无理化梯度。
故而设想把细胞固定在一定的支持物上，使它们之间密切接触，并形成一定的理化梯度。
如此，既可以保障细胞的营养需要，又可避免由于代谢产物的累积而对细胞代谢造成反馈抑制。
物质生产大多利用处于稳定增殖期的细胞，由于固定化抑制生长发育，因此应考虑尽可能模拟稳定期等等。
(完整版)海藻酸钠研究进展
海藻酸钠及其衍生物海藻酸钠（Sodium Alginate）,也叫褐藻酸钠、褐藻胶，是从褐藻中提取出来的一类多糖，它是褐藻的细胞膜组成成分，在海带中含量最为丰富，高达30%-40%。
通过干燥粉碎经水洗干净的海带，用1.5%的Na2CO3溶液浸泡、过滤，往滤液加入盐酸调pH<3，使海藻酸沉淀析出，再用1.5%的Na2CO3溶液将海藻酸转化成为海藻酸钠，最后用乙醇溶液沉淀出海藻酸钠产品[7,8]。
海藻酸钠便宜易得，用途十分广泛，用作纺织品上的浆剂和印花浆，同时作为增稠剂、稳定剂、乳化剂大量应用于食品工业中。
也应用于生物技术，包括细胞封装、蛋白质运载和组织工程等。
此外，由于海藻酸钠具有良好的生物相容性和生物降解性[9]，其在生物医药行业也得到了重视。
另外，海藻酸钠具有生物黏着性，因此可用作药用生物黏附材料。
海藻酸钠为白色或淡黄色的粉末，几乎无臭，无味，有吸湿性，不溶于乙醇、乙醚或酸（pH<3），溶于水形成粘稠状液体，1%水溶液pH值为6-8。
海藻酸钠是由α–L-古洛糖醛酸钠（a-L-guluronate，简称G）和β-D-甘露糖醛酸钠（β-D-mannuronate，简称M）1、4连接的长链线性多糖[10]，分子式为(C6H7O6Na)n，M和G以及海藻酸钠的结构式如图1-2所示。
其化学组成及M和G的序列取决于样品提取的来源。
海藻酸钠分子链在水溶液中呈线团状构象。
其中M/G的比值以及各嵌段的分布，与海藻酸钠的物理化学性质和应用有直接的关系。
海藻酸钠作为一种线性多糖，其分子链在溶液中呈线团状的分布，具有MM、MG、GG结构，其官能基尤其GG结构很容易与二价离子Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+等发生键合，键合有分子内交联与分子间交联两种形式，形成“egg-box”结构。
由于分子间的架桥作用，引起海藻酸钠溶液性质的显著改变，并且对不同二价阳离子的选择性不同[7]。
纳米药物控释体系纳米药物控释系统就是将药物制备成纳米级的胶体载体（colloidal carrier）系统，控制药物在特定的部位以特定的速率释放。
海藻酸钠包埋固定化微生物处理含油废水研究
二、材料和方法
实验所需的主要材料包括海藻酸钠、微生物菌株、培养基等。海藻酸钠作为 一种天然高分子物质，具有较好的生微生物菌株对含油废水进行处理。实 验方法主要包括以下几个步骤：
1、配制海藻酸钠溶液：将海藻酸钠溶解于蒸馏水中，配置成一定浓度的海 藻酸钠溶液。
最后，实验研究了包埋时间对固定化效果的影响。实验结果表明，随着包埋 时间的延长，固定化脂肪酶的活性逐渐提高。当包埋时间达到一定值时，固定化 脂肪酶的活性达到最大值，进一步延长包埋时间则可能导致活性下降。实验结果 提示，包埋时间选择应为最佳时间的中间值，以确保既不影响酶的活性又能够保 证固定化效果。
一、细胞固定化技术的概述
细胞固定化技术是一种能够保持微生物活性和高密度生长的技术。通过将微 生物固定在特定载体上，微生物可以保持在高度密集的状态下生长，同时保持其 生物活性功能。这种技术在工业发酵和废水处理等领域都有广泛的应用。在工业 发酵中，固定化微生物可以用于生产各种化学品、燃料和饲料等；在废水处理中， 固定化微生物可以用于去除废水中的有害物质，同时提高废水的处理效率。
2、微生物菌株的活化与培养：将保藏的微生物菌株在合适的培养基中进行 活化与培养，以恢复其活性。
3、包埋固定化微生物：将活化后的微生物菌株与海藻酸钠溶液混合，通过 搅拌、静置等方式形成微球，实现微生物的包埋固定化。
4、含油废水处理：将包埋固定化微生物微球投加至含油废水中，通过微生 物的作用实现对废水的处理。
在废水处理方面，海藻酸钠包埋法已经被广泛应用于处理各种类型的废水。 研究结果表明，通过海藻酸钠包埋法固定的微生物细胞可以有效地去除废水中的 有害物质，同时提高废水的处理效率。此外，该方法还可以用于制备生物燃料和 生产高价值化学品等。例如，一些研究人员已经成功地利用海藻酸钠包埋法将厌 氧消化污泥中的产甲烷菌固定化，并实现了高效稳定的产甲烷过程。
固定化脂肪酶载体的筛选研究
ｉ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄｔ ， Ｈ ｖ ｕ ， ｏ ｉ ｚ ｄｔｍｐ ｒｔ ｒ ｒ ０ｍｇ ８０ｈ， ． ４ ｂｌ ｅ ｍｅ ｐ ａ ｅ ｉ ｉ ｉ ｌ ｍｍ ｂｌ ｅ ｉ ｅ ｅ ａｕ ｅ ｗｅｅ３ ， ． ７０， ０℃ ， ｓ ｅ ｔ ｅｙ ｒ ｐ ｃｉ ｌ． ｅ ｖ
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和 催 化 生 成 不 同 产 物 时都 存 在 缺 点 。 ： 附 法 中酶 与 载 如 吸
２ ％的 乙酸 溶液 ． 制得 ２５ ． ％的壳 聚 糖酸 性 溶 胶 。 搅 拌边 将 边
上述 溶胶 缓慢 加入 到 ８ ０ｍＬ液体 石蜡 和 ５ｍＬＳ ａ ～ ０的 混 ｐ ｎ ８
合 液 中 ， 拌 ２ ｉ ， 溶胶 液 均 匀 分散 。 入 ２ ％戊 二 醛 搅 ０ｍ ｎ 使 加 ５
１ ． 试 验 方 法 ２
１ ． 脂肪酶 的海 藻酸 钠 固定 。 ．１ ２ 准确 称 取 １ 藻 酸钠 加 ． ｇ海 ０
化 合物 的拆分 、 油脂改 性 等方 面 的研究 ｌ］ 由于 脂肪 酶 的 ｌ。 －但 ３ 造价 昂贵 ， 对环 境 耐 受力 低 ， 定 性 较差 ， 游 离酶 不 易 于 稳 且
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海藻酸钠制备
海藻酸钠制备海藻酸钠是一种常见的天然高分子化合物，它是从海藻中提取出来的一种多糖类物质。
海藻酸钠具有很多的应用价值，比如在食品、医药、化妆品等领域都有广泛的应用。
本文将从海藻酸钠的制备方法、应用领域等方面进行介绍。
一、海藻酸钠的制备方法海藻酸钠的制备方法主要有两种，一种是从海藻中提取，另一种是通过化学合成得到。
1. 从海藻中提取从海藻中提取海藻酸钠是一种比较常见的方法。
首先需要将海藻进行清洗、烘干等处理，然后将其浸泡在碱性溶液中，使其膨胀，然后用酸性溶液进行酸化处理，使其释放出海藻酸。
最后通过沉淀、过滤、干燥等步骤得到海藻酸钠。
2. 化学合成化学合成是另一种制备海藻酸钠的方法。
这种方法需要使用化学试剂进行反应，将海藻酸和钠化合得到海藻酸钠。
这种方法虽然可以得到高纯度的海藻酸钠，但是其成本较高，不太适合大规模生产。
二、海藻酸钠的应用领域1. 食品领域海藻酸钠在食品领域中有广泛的应用，它可以作为增稠剂、乳化剂、稳定剂等。
比如在冰淇淋、果冻、饮料等食品中，海藻酸钠可以起到增稠、保持口感的作用。
2. 医药领域海藻酸钠在医药领域中也有很多的应用，它可以作为药物的缓释剂、吸附剂等。
比如在口腔溃疡贴片、眼药水等药物中，海藻酸钠可以起到缓解症状、促进愈合的作用。
3. 化妆品领域海藻酸钠在化妆品领域中也有很多的应用，它可以作为保湿剂、乳化剂、稳定剂等。
比如在面霜、洗发水、沐浴露等化妆品中，海藻酸钠可以起到保持皮肤湿润、增加产品稠度的作用。
海藻酸钠是一种非常有用的化合物，它在食品、医药、化妆品等领域都有广泛的应用。
随着科技的不断发展，相信海藻酸钠的应用领域还会不断扩大。
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海藻酸钠固定化脂肪酶的制备及性质研究
摘要：本文采用海藻酸钠包埋法得到了固定化脂肪酶。
通过条件优化得到了最佳固定化条件：海藻酸钠浓度1.5%，CaCl2浓度3%，固定化时间为1 h。
该固定化脂肪酶连续反应4批之后，酶活保持稳定，显示了较好的催化稳定性。
关键词：海藻酸钠脂肪酶固定化催化稳定性
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)，又称甘油三酯水解酶，是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸的酶类，许多脂肪酶还能催化酯化反应酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。
目前，脂肪酶已广泛应用于食品、医药、皮革、日用化工等行业。
但游离脂肪酶稳定性差、容易失活、难以回收利用等缺点，限制了其在工业生产中的应用。
通过固定化技术，将脂肪酶固定化在一定的载体上可以提高活力和稳定性，而且易于回收重复使用，因此酶固定化技术被广泛地应用，以降低生产成本、提高生产效率[1,2]。
海藻酸钠作为一种生物相容性较好、机械强度较高、对酶蛋白无毒副作用的高分子载体，经常用于酶催化剂的固定化[3,4]。
本文以海藻酸钠作为载体，制备固定化脂肪酶，并对固定化条件和酶学性质作了详细的研究。
1实验部分
1.1仪器与试剂
恒流泵（苏州江东精密仪器有限公司，BT-100B），恒温水浴振荡器（太仓市实验设备厂，SHZ-88A），多能搅拌器（金坛市白塔金昌实验仪器厂，HJ-5），分析天平（AB204-N）。
海藻酸钠（生物级，阿拉丁试剂（上海）有限公司），牛胰脂肪酶（13-35 units/mg），橄榄油（分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司），聚乙烯醇（分
析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司），其余试剂均为分析纯。
1.2 固定化脂肪酶的制备
将海藻酸钠加热溶解，使海藻酸钠最终浓度为1.5% (w/v)，冷却后使海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，用蠕动泵滴入3.0% (w/v)的CaCl2溶液中，固定化一定时间后，滤出颗粒，用0.9%(w/v)生理盐水洗净后，浸在相同浓度的生理盐水中备用。
1.3 固定化脂肪酶活性的检测
取0.5 g固定化脂肪酶加到2 ml底物（按比例橄榄油∶聚乙烯醇∶缓冲液= 1∶3∶5）中，于30 ℃下，水浴恒温振荡器中反应30 min。
反应结束后，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，酚酞作为指示剂。
酶活定义：在反应条件下，每分钟水解形成1μmo1脂肪酸所需酶量为1个酶活力单位(U)。
2 结果与分析
2.1海藻酸钠浓度对酶活的影响
海藻酸钠的浓度会影响固定化酶的机械强度以及物质的在颗粒内部的扩散，进而影响催化剂的活性。
如图1所示，当海藻酸钠浓度为 1.5％时，固定化酶的活力最大，所以选择海藻酸钠最适浓度为1.5％。
2.2 CaCl2浓度对酶活的影响
将1.5%海藻酸钠溶液与酶液混合后用蠕动泵分别滴入1，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0% (w/v)浓度的CaCl2溶液中，固定化1小时
后，滤出颗粒，用生理盐水洗净，测定固定化酶的活性，结果如图2所示。
当CaCl2浓度为3％时，固定化酶活性最高。
2.3 固定化时间的考察
将1.5% 海藻酸钠溶液与酶液混合后用蠕动泵滴入3%的CaCl2溶液中，分别固定化0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后，滤出颗粒，用生理盐水洗净，测定固定化酶的活性。
结果如图3所示。
有图可知，开始固定化时，固定化酶的活性呈升高趋势，到1 h时固定化酶活达到最大；随着固定化时间延长，固定化酶的活性又逐渐降低，这可能是因为随着固定化时间延长，海藻酸钠中的Na+逐渐被Ca2+替换，高分子结构致密，底物扩散阻力增加。
所以固定化最佳时间为1 h。
2.4 固定化酶批次稳定性考察
将每一批次固定化脂肪酶反应后用蒸馏水润洗，然后继续进行下一批实验，测定每一批次的固定化酶酶活。
由图4可知，在前四批反应过程中，固定化酶的酶活保持稳定性，第五批之后，酶活有了明显的下降，到第7批，酶活下降为零，这可能是由于固定化颗粒崩解所致。
3 结论
本文采用直接包埋法制备了海藻酸钠固定化脂肪酶，对固定化条件进行了优化，得到了催化活性较高、稳定性较好的固定化脂肪酶。
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