柑橘溃疡病生防细菌的分离鉴定

柑橘溃疡病生防细菌的分离鉴定陈娇梅;蔡学清;邱思鑫;胡方平【摘要】为了从柑橘上获得能防治柑橘溃疡病的生防细菌,从福州3个地区的柑橘园采集不同柑橘品种的叶片、春稍和花,用稀释分离法分离得到84株细菌菌株,用平板抑菌圈法筛选获得11株对柑橘溃疡病菌具有拮抗作用的菌株;用离体叶片防效筛选获得39株对柑橘溃疡病具有50％以上防效的菌株,占菌株总数的46.4％.对3株防效显著的拮抗菌株YH1、YS5和NY20进一步进行防效测定,结果表明:菌株培养液的防治效果最好,菌体次之,代谢产物最差;对这3株细菌的β-1,4-葡聚糖酶、蛋白酶和β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活性进行测定,结果表明酶活性的强弱与防病效果有一定的相关性.经过16S rDNA序列分析,革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和生理生化测定,确定这3个菌株均属于芽孢杆菌属,其中菌株YH1鉴定为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2014(035)007【总页数】6页(P1398-1403)【关键词】柑橘溃疡病;拮抗菌;芽孢杆菌;生物防治【作者】陈娇梅;蔡学清;邱思鑫;胡方平【作者单位】福建农林大学植物保护学院,福建福州 350002;福建农林大学植物保护学院,福建福州 350002;福建省农业科学院作物研究所,福建福州 350013;福建农林大学植物保护学院,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S476doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.025柑橘溃疡病（Xanthomonas axonopodis pv.）是影响全球柑橘产业发展的重大顽固细菌性病害，已经被世界上30多个国家和地区定为植物检疫性有害生物[1]。

目前中国以广东、福建、台湾、广西、四川等省区的柑橘受害最重，湖南和其他柑橘产区也都有不同程度受害[2]。

该病害可危害芸香科数十种植物，传播途径广、传染迅速、危害严重，对农业生产造成巨大损失[3-5]。

生产上主要使用的化学农药依然是常见的几种，缺乏推陈出新[6]。

长期使用化学农药不但会使病菌产生抗性，而且会污染环境，造成农药残留，对人体产生负面影响。

近年来，随着人们对农产品品质和安全性要求的提高，使柑橘溃疡病的生物防治得到了重视，并开展了一系列的研究工作。

如周吉奎等[7]报道了从柑橘叶片和果实表面分离的K-2与K-8两株拮抗细菌在温室和大田防治试验中对柑橘溃疡病都有良好的防治效果；张洪波等[8]在柑橘表面分离到的葡萄糖杆菌属Kx15菌株和乳酸杆菌属Kx48菌株，在温室对柑橘溃疡病的防治效果分别达到45.6%和55.6%；陈力等[9]研究确定了从柑橘叶表面分离的枯草芽孢杆菌CQBS03抑菌活性成分是蛋白质，对柑橘溃疡病的抑菌活性高并且稳定。

易龙等[10]从脐橙根际土壤分离的枯草芽孢杆菌G32，在室内对柑橘溃疡病的预防效果达60.7%。

谭小艳等[11-13]研究报道，从柑橘园土壤中、柑橘叶片表面和柑橘叶片中分别分离的鲍氏不动杆菌Bt8、枯草芽孢杆菌Bv10和洋葱伯克霍尔德氏菌Bc51，在温室测试中，分别获得了55.2%、42.9%和60.3%的病斑抑制效果；以上这些研究主要集中在湖南、江西等地，为获得对福建柑橘溃疡病有较好防效的菌株，本研究拟从福建福州3个柑橘园采摘叶片、春稍和花进行分离筛选，并对其抑菌、防病作用及其分类学地位进行研究，为柑橘溃疡病的生物防治提供理论依据。

1.1 材料1.1.1 供试植物福桔（8年生）、脐橙（6年生）和南丰蜜橘（3年生）于2011年4～5月份分别从福州闽侯南通镇、福清渔溪镇和东张镇柑橘园采集。

1.1.2 供试菌株柑橘溃疡病菌（K5）Xanthomonas axonopodis pv.citri（Xac.）由本实验室鉴定保存和枯草芽孢杆菌（BS168）Bacillus subtilis由美国芽孢杆菌遗传保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）惠赠。

1.1.3 供试试剂Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]、16S rDNA扩增的上游引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3′）和下游引物（1492R：5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′）[14]（上海生物工程技术服务有限公司）、Taq DNA聚合、dNTPS、10×PCR Buffer [宝生物工程（大连）有限公司]、琼脂糖、TBE[15]、Biospin胶回收试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]、TaKaRa pMD 18-T Vector[宝生物工程（大连）有限公司]。

1.1.4 供试培养基[16]柑橘细菌的分离和培养采用NA、NB培养基。

1.2 方法1.2.1 柑橘组织细菌的分离用清水将样品（叶片、春稍、花）冲洗干净，晾干；在无菌操作台用无菌水漂洗3次，晾干后转入灭菌过的研钵中，加适量无菌水研磨成浆（无菌水量没过研磨浆为准），静置30min，取25、50、100μL在NA培养基平板涂布。

28℃恒温箱中培养48～72 h，根据菌落形态、颜色等分别挑取不同类型单菌落，纯化保存备用。

1.2.2 拮抗菌株的平板筛选以柑橘溃疡病菌为靶标菌，采用平板抑菌圈法筛选其中的拮抗菌株[17]。

先把培养48h的柑橘溃疡病菌用无菌水配成悬浮液（OD600=0.5），然后将100mL NA培养基融化并冷却至45℃左右加入病原菌的悬浮液1mL，倒好平板，吹干后在每个平板上等距离点接5株待测细菌，28℃恒温箱中培养，并于48、72 h观察抑菌情况，并测量其抑菌透明圈半径。

1.2.3 分离细菌离体叶片防效的测定参照李云锋等[18]方法采摘无虫无病的新抽出的功能叶（品种福桔），洗净，晾干，每张叶片背面用灭菌大头针预先针刺5个孔。

本实验共设3个处理，（1）先用灭菌滤纸沾70μL的待测分离菌株培养液（28℃摇床培养2 d，浓度约为5×108cfu/L）贴于叶片针刺伤口上，将叶片置于无菌培养皿中，底部滤纸用无菌水润湿，然后将培养皿置于塑料盆中，套袋保湿，置28℃恒温箱中培养24 h后，将原先的滤纸取下，在叶片针刺伤口处贴上沾70μL的柑桔溃疡病菌（OD600=1.0）的灭菌滤纸。

（2）先用灭菌滤纸沾70μL 的清水，24 h后撕下并贴上沾有70μL的柑橘溃疡病原菌菌液（OD600=1.0）。

（3）单接清水。

每个处理重复3次，置于28℃恒温箱中培养并定期观察结果。

统计公式：发病率/%=（发病针孔数／总针孔数）×100；防治效果/%=[(病菌处理区发病率－生防菌处理区发病率)／病菌处理区发病率]×1001.2.4 拮抗菌防效的测定取1 mL拮抗菌菌株培养液（28℃摇床培养48 h，浓度约为5×108cfu/ L）12 000 r/min离心10min，分别收集其菌体和上清液（即代谢产物），上清液用细菌过滤器（滤膜孔径0.22μm）过滤1次，菌体用无菌水清洗1次，再用1mL无菌水配成菌体悬浮液，备用。

接种方法、发病率和防治效果的统计方法同1.2.3。

1.2.5 拮抗菌胞外酶活性的测定β-1,4-内切葡聚糖酶活性参照范晓静等[19]方法测定；β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶活性参照张秀艳等[20]方法测定；蛋白酶活性参照何召明等[21]的方法进行测定。

1.2.6 拮抗菌株的鉴定（1）16S rDNA测序。

拮抗菌株16S rDNA测序包括总DNA的提取、PCR扩增、连接转化等，参照分子克隆第三版[15]的方法进行。

将回收的16S rDNA片段送到上海生物工程技术服务有限公司序列测定，对测序得到的基因序列利用GenBank中的BLAST软件进行同源性分析，利用MEGA3.1软件构建系统发育树。

（2）形态特征和生理生化特性测定。

革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢和晶体染色等形态学观察参照方中达[16]的方法进行，而其运动性测定、接触酶试验、甲基红和V-P试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解、明胶液化和吲哚试验等生理生化测定参照东秀珠等[22]的方法进行。

以枯草芽孢杆菌BS168为对照菌株。

2.1 柑橘细菌的分离纯化与拮抗菌筛选从福州地区3个橘园采集的福桔、脐橙、南丰蜜橘的叶片、春稍、花上共分离获得84株细菌。

其中从福桔上分离到的菌株最多，为39株；脐橙次之，为26株；南丰蜜橘最少，只有19株。

通过平板拮抗实验，结果表明有11株菌株对柑橘溃疡病菌具有不同程度的拮抗作用，占筛选菌株总数的13.1%（表1）。

其中以菌株YH1对柑橘溃疡病菌的拮抗效果最好，72 h抑菌带半径宽达4.5mm。

2.2 离体叶片的防治效果通过离体叶片对柑橘溃疡病进行防治实验测定，结果发现有60株细菌对离体叶片柑橘溃疡病具有防治效果，占菌株总数的71.4%，防效大于50%的菌株有39株，占菌株总数的46.4%。

对其中防效最好的7株菌株进行复筛（表2），结果发现接种处理10 d后，供试的7株菌株防治效果均在70%以上。

接种处理14 d后，菌株YH1、YS5和NY20的防治效果最好，达90.9%～100%。

对上述3株生防细菌的培养液（菌体+代谢产物）、菌体及其代谢产物分别进行防病效果测定（表3），供试菌株的菌体+代谢产物、菌体及其代谢产物均对柑橘离体叶片溃疡病有一定的防效。

不同菌株相同处理防效不同，以菌株YS5的防效最好；同一菌株不同处理的防效也不同，以菌体+代谢产物的防治效果最好，菌体次之，菌液的上清液即代谢产物的防治效果最差。

生防菌处理的叶片即使每个针刺伤口都发病，但病斑明显小，可见生防菌能有效地抑制病斑的生成和扩展。

2.3 拮抗细菌胞外酶活性柑橘拮抗细菌胞外酶活性测定结果如表4。

测定结果表明菌株YH1、YS5、NY20均具有蛋白酶活性和较高的β-1,4-内切葡聚糖活性，但只有YH1菌株具有β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶活性。

2.4 拮抗细菌16S rDNA鉴定测序结果表明，拮抗菌株YH1、YS5和NY20 16S rDNA序列长度分别为1471、1474、1474 bp。

利用NCBI数据库中的BLAST软件分析结果表明，菌株YS5和NY20的16S rDNA序列与已知菌株B.cereus、B.anthracis、B.thuringiensis等的16S rDNA序列的同源性均在99%以上，YH1菌株的16S rDNA序列与已知菌株B.pumilus的16S rDNA序列的同源性99%以上，选取10株近缘种构建系统发育树（图1和图2），可以看出菌株YS5和NY20可能为B.thuringiensis或B.cereus，而菌株YH1为B.pumilus。